自噬在小鼠圍著床期子宮中的作用.pdf

1、目的：
　　胚胎著床是妊娠的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是具備著床能力的胚胎與容受態(tài)子宮建立緊密聯(lián)系的過程。圍著床期小鼠子宮主要依賴以下步驟完成胚胎著床過程：小鼠子宮在孕D4天處于容受態(tài)，子宮內(nèi)膜處于允許囊胚粘附的狀態(tài)；在小鼠孕D5天，囊胚粘附并侵入子宮內(nèi)膜，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞隨即廣泛地增殖和分化，發(fā)生蛻膜化樣改變，孕D6天形成初級(jí)蛻膜區(qū)。胚胎的正常著床對(duì)于后續(xù)妊娠維持、分娩均起著重要的作用。然而，目前關(guān)于胚胎著床機(jī)制的研究還不夠全面。自噬是存在于真

2、核細(xì)胞的普遍現(xiàn)象，依賴溶酶體對(duì)物質(zhì)進(jìn)行降解，來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的更新。近年研究證實(shí)自噬參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展；胚胎侵入子宮與腫瘤發(fā)生過程存在相似性，但是自噬是否參與胚胎著床過程并未見報(bào)道。課題組前期基因芯片研究發(fā)現(xiàn)孕D5天小鼠著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜中自噬相關(guān)標(biāo)志分子的表達(dá)低于著床旁子宮內(nèi)膜。因此，我們推測(cè)自噬可能參與了圍著床期子宮內(nèi)膜正常功能的維持，進(jìn)而調(diào)節(jié)胚胎著床。
　　方法：
　　1.自噬相關(guān)標(biāo)志分子在圍著床期小鼠子宮內(nèi)

3、膜中的表達(dá)
　　1）建立小鼠正常妊娠模型，收集孕D4、D5、D6天小鼠子宮內(nèi)膜，采用 Western Blot檢測(cè)小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜中自噬相關(guān)標(biāo)志分子LC3、ATG5的表達(dá)。
　　2）建立小鼠正常妊娠模型，收集孕D5天著床點(diǎn)與著床旁子宮內(nèi)膜組織。采用透射電鏡尋找自噬小體，分別用Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)標(biāo)志物CathepsinB、P62等分子在著床點(diǎn)和著床旁子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)。

4、>　　3）建立自噬抑制劑3-MA干預(yù)的小鼠妊娠模型，收集孕D5天小鼠子宮著床點(diǎn)與著床旁子宮內(nèi)膜組織；驗(yàn)證模型建立成功后，尾靜脈注射臺(tái)盼藍(lán)后觀察小鼠胚胎著床情況，HE染色觀察自噬被抑制后小鼠子宮組織形態(tài)的改變。并采用Western Blot檢測(cè)自噬抑制后蛻膜化標(biāo)志因子HOXA10、PR的表達(dá)。
　　2.自噬在子宮蛻膜化中的作用
　　1）建立假孕小鼠人工誘導(dǎo)蛻膜化模型，收集誘導(dǎo)蛻膜化側(cè)和對(duì)照側(cè)子宮內(nèi)膜組織；分別使用Real-ti

5、me PCR和Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)標(biāo)志物 CathepsinB、ATG5、P62等分子在誘導(dǎo)蛻膜化側(cè)以及對(duì)照側(cè)子宮內(nèi)膜中的表達(dá)。體外分離并培養(yǎng)小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞蛻膜化后，Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3、ATG5、P62的表達(dá)。
　　2）建立自噬抑制劑3-MA干預(yù)的假孕小鼠人工誘導(dǎo)蛻膜化模型，驗(yàn)證模型建立成功后，使用Western Blot檢測(cè)自噬抑制后蛻膜化標(biāo)志因子HOXA10、PR的表達(dá)

6、，HE染色觀察自噬被抑制后的子宮組織形態(tài)。體外分離并培養(yǎng)小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞，自噬抑制劑3-MA處理細(xì)胞后誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化，檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志因子HOXA10、PR的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.自噬相關(guān)標(biāo)志分子在圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)
　　1）自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3-II、ATG5在小鼠孕D5、D6天子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平較孕D4天顯著降低。
　　2）自噬小體的數(shù)目在孕D5天著床點(diǎn)低于著床旁，自噬相關(guān)標(biāo)志分子Ca

7、thepsinB、P62 mRNA水平及蛋白水平在小鼠孕D5天著床點(diǎn)顯著低于著床旁。
　　3）自噬抑制劑3-MA干預(yù)后，肉眼觀察可見孕鼠胚胎著床點(diǎn)數(shù)量無顯著差異，但分布不均。HE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠孕D5天子宮腔上皮出現(xiàn)異常折疊且植入室閉合不完全。此外，子宮蛻膜化標(biāo)志因子HOXA10、ER-α、PR蛋白的表達(dá)均顯著降低。
　　2.自噬在子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用
　　1）與對(duì)照側(cè)相比，人工誘導(dǎo)蛻膜化側(cè)的小鼠子宮內(nèi)膜組織中自噬相關(guān)標(biāo)

8、志分子P62、ATG5、CathepsinB、ULK1以及BECN1 mRNA表達(dá)顯著降低;自噬相關(guān)分子LC3-II、ATG5以及 P62蛋白在誘導(dǎo)蛻膜化側(cè)子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。原代分離培養(yǎng)小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，體外誘導(dǎo)蛻膜化后，自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3-II、ATG5、P62蛋白表達(dá)水平較未誘導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞顯著降低。
　　2）肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，自噬抑制劑3-MA干預(yù)組中誘導(dǎo)蛻膜化側(cè)子宮外觀異常，且子宮濕重顯著降低；H