HCMV重組嵌合抗原表達(dá)及其診斷初步應(yīng)用.pdf

1、目的:選用人巨細(xì)胞病毒(HCMV)抗原性強(qiáng)且親水性高的基因片段構(gòu)建的三種重組嵌合抗原,誘導(dǎo)、表達(dá)、純化獲得目的蛋白;采用ELISA法檢測(cè)合肥地區(qū)孕婦、兒童等血清HCMV的感染情況,并平行比較構(gòu)建的三種重組嵌合抗原的敏感性和特異性,并分析感染HCMV的孕婦、兒童、腫瘤疾病等相關(guān)危險(xiǎn)因子。
　　方法:通過(guò)Protean軟件分析了的HCMV UL32、UL44、UL55、UL83、UL123序列,通過(guò)設(shè)計(jì)合理引物,各基因片段用Overl

2、ap PCR方法連接,并引入Bgl II、BamHI酶切位點(diǎn),成功構(gòu)建這三種重組質(zhì)粒且經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),重組蛋白用 Ni2+NTA親和層析的方法純化獲得:HCMV pQE80-L-UL32-UL44-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83-UL123。采用Wester n blot法檢測(cè)免疫反應(yīng)性。利用這三種重組蛋白作為抗原建立和優(yōu)化了HCMV血清學(xué)檢測(cè)EL

3、ISA方法,檢測(cè)安徽合肥地區(qū)76例孕婦、150例呼吸道疾病兒童和43例腫瘤患者的血清。運(yùn)用SPSS16.0軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析處理。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了HCMV重組嵌合抗原表達(dá)質(zhì)粒,并能夠誘導(dǎo)表達(dá)于大腸桿菌中,并且也較高純度的純化出了目的蛋白,驗(yàn)證其具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性,建立重組抗原ELISA檢測(cè)方法。與商業(yè)試劑盒比較其重組抗原的敏感度、特異性均為100％,而商業(yè)試劑盒的特異性為100%,敏感度為97.6%。
　?、僭袐D血

4、清HCMV IgG陽(yáng)性率為55.3%,其中,孕周在18～21周的孕婦感染率為75%,Logistic回歸分析結(jié)果顯示:HCMV感染率與孕婦孕周、年齡、AFP(甲胎蛋白)、HCG(人絨毛膜促性腺激素)、游離雌三醇(uE3)水平以及糖尿病均無(wú)顯著差異性(P>0.05)。②兒童血清HCMV陽(yáng)性率為32.7%,Logistic回歸分析結(jié)果顯示:兒童年齡、淋巴細(xì)胞百分比水平及呼吸道感染中患 MPP(肺炎支原體肺炎)與 HCMV感染率之間有顯著相關(guān)

5、性(P<0.05);而性別、WBC(白細(xì)胞)、RBC(紅細(xì)胞)、PLT(血小板)、CPR(C反應(yīng)蛋白)水平與 HCMV感染率之間均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。呼吸道疾病兒童血清KSHV陽(yáng)性率為16.7%,Logistic回歸分析結(jié)果顯示:兒童年齡、性別、WBC、RBC、PLT、淋巴細(xì)胞百分比及CRP水平與感染率之間均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。③腫瘤患者HCMV陽(yáng)性率為20.9%,其感染HCMV陽(yáng)性的有9例,Logistic回歸分析

6、結(jié)果顯示:年齡、性別、腫瘤均與HCMV感染率無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。④腫瘤患者KSHV陽(yáng)性率為30.2%,其感染HCMV陽(yáng)性的有13例,Logistic回歸分析結(jié)果顯示:腫瘤與KSHV感染率有顯著相關(guān)性(P<0.05)。
　　HCMV IgG血清抗體陽(yáng)性率與KSHV血清抗體陽(yáng)性率之間比較,150份兒童血清中,HCMV IgG抗體陽(yáng)性率為32.7%,KSHV抗體陽(yáng)性率為16.7%,兩抗體陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.93,

7、P=0.002)。76例孕婦的血清HCMV IgG抗體陽(yáng)性率為55.3%,KSHV感染陽(yáng)性率為1.3%,兩抗體陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=39.09,P=0.000)。43例腫瘤患者的血清中HCMV感染率為20.9%,KSHV感染率為30.2%,兩抗體陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.125,P=0.289)。
　　結(jié)論:構(gòu)建了HCMV重組嵌合抗原表達(dá)質(zhì)粒,并成功誘導(dǎo)表達(dá)于大腸桿菌中,且也較高純度的純化出了目的蛋白,驗(yàn)證其具有較

8、強(qiáng)的免疫反應(yīng)性,建立重組抗原的檢測(cè)方法。在血清學(xué)檢測(cè)中HCMV感染率與孕婦的孕周、AFP、HCG及雌激素水平均無(wú)相關(guān)性;其中肺炎支原體肺炎與HCMV感染率相關(guān),以及在10.01～12月和淋巴細(xì)胞比例大于40.01%均與HCMV感染率有顯著相關(guān)性;提示HCMV感染與呼吸道感染之間有密切關(guān)系,認(rèn)為可能是由于兒童HCMV活動(dòng)期感染導(dǎo)致肺功能下降,免疫力低下誘發(fā)支原體肺炎的發(fā)生,誘使呼吸道感染反復(fù)發(fā)作;也可能是兒童MPP感染使免疫功能改變,增加