細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4單克隆抗體在荷人T細胞淋巴瘤Jurkat細胞裸鼠中作用的實驗研究.pdf

1、目的:已有國外文獻及我科前期實驗證明,CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(CD4+CD25+regulatory T cell,Tr)是一種免疫抑制性調節(jié)細胞,可以抑制機體識別自身腫瘤細胞的腫瘤效應細胞的發(fā)育和活化,在介導腫瘤免疫耐受與腫瘤免疫逃逸中起重要作用,在初治非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma,NHL)患者外周血中CD4+CD25+Tr細胞比例明顯升高,初治患者CD4+CD25+Tr細胞比例較正常對照組CD4+C

2、D25+Tr細胞比例明顯升高,化療后完全緩解者(CR)及部分緩解者(PR)CD4+CD25+Tr細胞比例與治療前均有顯著性差異。且初治NHL患者外周血CD4+CD25+Tr細胞比例與患者年齡、性別、PS狀態(tài)、臨床分期、病理類型之間未發(fā)現(xiàn)明顯相關性。通過上面的結果,可以認為,CD4+CD25+Tr細胞比例是一個較好的反映細胞免疫功能狀態(tài)的參考指標之一。如能阻斷CD4+CD25+Tr細胞活化、增殖的途徑,將打破機體對腫瘤細胞的耐受,從而引起

3、機體對腫瘤細胞的免疫作用,清除腫瘤細胞。細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T lymphocytic associated antigen,CTLA-4)是活化T細胞表面表達的一種跨膜糖蛋白分子,與B7和CD28同屬免疫球蛋白超家族成員?，F(xiàn)代免疫學研究發(fā)現(xiàn),初始T細胞的完全激活需要雙重信號的刺激,既需要T細胞上抗原受體(TCR)提供的抗原特異性信號,即T細胞上TCR和APC加工處理的抗原肽-MHC復合物結合(第一信號)

4、,還必需有抗原非特異性共刺激(COSTIMULATION)信號(第二信號),若缺乏第二信號的輔助,將使T細胞處于克隆無能(anergy)狀態(tài)。雖然CTLA-4在活化T細胞膜上的表達量僅為CD28的1/30～1/50,但它與B7的親和力是CD28與B7的20倍以上,是T細胞活化中重要的調節(jié)分子。CTLA-4單克隆抗體可以阻斷CTLA-4與T細胞的結合位點,從而阻斷T細胞的活化、增殖,進一步抑制CD4+CD25+Tr細胞的激活,使CD4+C

5、D25+Tr細胞在抑制機體對腫瘤細胞免疫作用減弱,近年來,CTLA-4單克隆抗體作為一種有效的治療手段顯示了其廣闊的應用前景。CTLA-4單克隆抗體已在多種自身免疫性疾病、移植抗排斥、基因治療上進行廣泛的臨床應用研究,但在惡性腫瘤,尤其是血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的應用還罕有研究。通過上面CTLA-4單克隆抗體作用機制的闡述,我們可以預測CTLA-4單克隆抗體在血液系統(tǒng)惡性疾病,尤其是惡性淋巴瘤的治療上會有廣闊的應用。本試驗通過CTLA-4單克

6、隆抗體在荷淋巴瘤裸鼠體內阻斷CD4+CD25+Tr細胞的活化、增殖,從而打破機體對腫瘤細胞的耐受,抑制腫瘤細胞生長。從而驗證CTLA-4單克隆抗體對淋巴瘤的作用。同時探討CTLA-4單克隆抗體在淋巴瘤細胞增殖、凋亡中的作用及其可能的機制,為淋巴瘤的靶向治療提供新的思路。
　　 方法:
　　 1人淋巴瘤Jurkat細胞株的培養(yǎng)和傳代
　　 人T細胞淋巴瘤Jurkat細胞用含10％新生小牛血清的RPMl1640培養(yǎng)液

7、培養(yǎng),置于37℃、5％CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中,2-3d換液傳代。
　　 2荷人淋巴瘤Jurkat細胞裸鼠模型的建立
　　 5周齡左右的Balb/c裸鼠,4Gy照射,3d后于右腋皮下接種Jurkat細胞每只0.2mL(每1mL含3×107個Jurkat細胞)。待瘤塊長至一定大小后,處死荷瘤裸鼠。無菌條件下將瘤塊分割成2-3mm的均勻小塊,注入10只5周齡左右的Balb/c裸鼠頭背部皮下。10d以后,發(fā)現(xiàn)瘤塊長勢良好

8、。隨機分為2組,分別為實驗組與空白組,每組5只,在腫瘤體積長至100mm3左右時開始給藥。
　　 3腹腔給藥
　　 將CTLA-4單克隆抗體稀釋為(2g/L),每只裸鼠腹腔內注射0.2ml(約0.4mg),共兩天。
　　 4實際測量給藥后腫瘤生長情況
　　 用藥后測量腫瘤體積,每周2次,共4周。
　　 5處死裸鼠
　　 用藥后4周,處死所有裸鼠,剖取腫瘤組織,將每只裸鼠的腫瘤組織分為5部分

9、。并取血約1mL加入EDTA-K2抗凝。
　　 6 HE染色光鏡下觀察用藥前后腫瘤組織形態(tài)變化
　　 取腫瘤組織固定、脫水、浸蠟,制備成石蠟塊。切片,HE染色、封片,顯微鏡下觀察實驗組與空白組腫瘤組織形態(tài)。
　　 7免疫組織化學觀察用藥后腫瘤組織CD4+、CD8+T細胞浸潤情況
　　 取裸鼠腫瘤組織,固定、石蠟包埋、切片,SP法染色。參照試劑說明進行陽性結果判定,PBS緩沖液代替—抗作為陰性對照,以細胞內

10、出現(xiàn)棕黃色為陽性細胞。每張組織切片隨機觀察5個高倍視野(×200),每高倍視野計數(shù)200個細胞,以陽性細胞百分比為計數(shù)結果。
　　 8流式細胞術(FCM)檢測用藥前后裸鼠外周血中CD4+CD25+Tr細胞的變化
　　 取EDTA-K2抗凝血0.1ml,分別加入CD4、CD25抗體各20μL,室溫下孵育30分鐘,加入紅細胞裂解液,用破膜劑及固定劑處理紅細胞,然后上機檢測。應用Expo32 ADC進行免疫熒光數(shù)據分析,用Mu

11、ticycleAV分析對DNA細胞周期擬合分析。
　　 9半定量RT-PCR技術檢測Jurkat細胞β-catenin、survivin、c-myc和cyclinD1 mRNA表達
　　 提取每只裸鼠腫瘤細胞總RNA,鑒定RNA純度,檢測RNA完整性,引物設計,所有RT-PCR引物均由上海生物工程公司合成,細胞總RNA預溫后,加入逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)(二步法)反應體系進行反轉錄,得到cDNA。再進行PCR

12、擴增,取擴增產物,加樣于瓊脂糖凝膠加樣孔中,電泳30min,用凝膠成像系統(tǒng)分析并拍攝圖象,采用Gel-ProAnalyzer3.1分析軟件分析條帶光亮度,對其進行半定量分析實驗,計算相對系數(shù)。
　　 流式細胞術(FCM)檢測腫瘤細胞周期的變化及凋亡
　　 將裸鼠腫瘤組織制備為單細胞懸液上流式細胞儀檢測腫瘤細胞周期變化及凋亡。
　　 11統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據進行統(tǒng)計分析
　　 結果:
　　

13、 1 CTLA-4單克隆抗體抑制人淋巴瘤Jurkat細胞在裸鼠體內增殖,在一定劑量下呈時間依賴關系。隨著藥物作用時間的延長,腫瘤細胞體積較空白組增長緩慢。可繪為時間、體積曲線圖。
　　 2光鏡下空白組裸鼠腫瘤細胞呈彌漫浸潤,瘤細胞為中等大小,核圓形或不規(guī)則圓形,核膜清楚,核分裂象易見,實驗組腫瘤細胞較空白組浸潤程度低,中等大小,核多為圓形,核膜清楚,核分裂相較少。
　　 3 CTLA-4單克隆抗體可降低裸鼠腫瘤組織中CD

14、4+及CD8+T細胞的比例。免疫組化分析結果顯示空白組CD4+T細胞浸潤比例為(57.5±1.3％),CD8+T細胞浸潤比例為(31.7±1.1％),實驗組CD4+T細胞比例為(25.3±0.9％),CD8+T細胞比例為(18.4±0.7％),兩組有顯著差異(P＜0.05)。
　　 4 CTLA-4單克隆抗體可降低裸鼠外周血中CD4+CD25+Tr細胞的比例?？瞻捉MCD4+CD25+Tr細胞的比例為(6.26±3.95)％,實驗

15、組CD4+CD25+Tr細胞的比例為(1.96±0.92)％,空白組與實驗組有顯著差異(P＜0.05)。
　　 5 RT-PCR檢測結果顯示,人淋巴瘤Jurkat細胞可擴增出特異性條帶,與擬擴增分子片段大小相符。經CTLA-4單克隆抗體處理4周后,人淋巴瘤Jurkat細胞β-catenin mRNA表達水平并沒有明顯變化,與空白組相比沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。而β-catenin/TCF下游靶基因c-myc、cyclinD

16、1和survivin mRNA表達水平卻降低了,與空白組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 6流式細胞術檢測結果顯示,CTLA-4單克隆抗體處理后,Jurkat細胞出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰,且細胞凋亡率明顯增加,CTLA-4單克隆抗體作用4周的細胞凋亡率(15.52％)明顯高于空白組細胞的凋亡率(3.46％);CTLA-4單克隆抗體作用后G0/G1期細胞(28.73％)較空白組(17.54％)明顯增加,S期細胞明顯減少,兩

17、組間差異有顯著性(P＜0.05),CTLA-4單克隆抗體能使細胞停滯在G0/G1期。
　　 結論:
　　 1在一定劑量下,CTLA-4單克隆抗體減緩人淋巴瘤Jurkat細胞在裸鼠體內增殖,呈時間依賴關系。
　　 2 CTLA-4單克隆抗體可使腫瘤細胞在裸鼠體內浸潤程度減低。
　　 3經CTLA-4單克隆抗體處理后,裸鼠腫瘤組織中CD4+T細胞及CD8+T細胞浸潤比例減低。
　　 4 CTLA-4單