六味地黃丸對(duì)AD細(xì)胞模型中TBP-2-RAGE蛋白表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的：
　　1、用不同濃度的Aβ25-35刺激 C6細(xì)胞，觀察細(xì)胞活力和形態(tài)及檢測(cè)硫氧還蛋白結(jié)合蛋白-2(thioredoxin binding protein，TBP-2)、硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low-density lipoprotein recept

2、or-related protein，LRP1)表達(dá)的改變，為建立AD細(xì)胞模型提供依據(jù)。
　　2、用不同濃度的六味地黃丸含藥血清（Liuweidihuang serum，LWDHS）刺激C6細(xì)胞，觀察細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)及檢測(cè) TBP-2、TRX、RAGE、LRP1表達(dá)的改變，篩選出合適的LWDHS含藥血清濃度，為研究中醫(yī)藥（LWDHS）對(duì)AD細(xì)胞模型產(chǎn)生的影響提供依據(jù)。
　　3、用篩選的合適濃度的LWDHS含藥血清干預(yù) AD

3、細(xì)胞模型，觀察六味地黃丸含藥血清（LWDHS）對(duì) AD細(xì)胞模型細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)及 TBP-2、TRX、RAGE、LRP1表達(dá)的影響，并探討其作用的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、制備Aβ25-35蛋白溶液：用無菌超純水將1mg的Aβ25-35配制成1000μmol/L母液，將其置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行“老化”5d，分裝-80℃保存，使用前稀釋到所需工作濃度。
　　2、將Aβ25-35蛋白溶液分為0.1μmol/L、1μ

4、mol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L五個(gè)濃度組干預(yù) C6細(xì)胞24后，用 MTT法檢測(cè) Aβ25-35對(duì) C6細(xì)胞活力的影響，并觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；用 Western Blot方法檢測(cè) Aβ25-35對(duì) C6細(xì)胞中TBP-2、TRX、RAGE、LRP1蛋白表達(dá)的變化。
　　3、制備含藥血清：SD雄性大鼠（250±20g），六味地黃丸濃縮丸（宛西制藥），1.08g/kg灌胃，每天2次，第4天早上灌胃后2小時(shí)

5、腹主動(dòng)脈取血制備LWDHS。
　　4、將LWDHS分為2.5％、5%、10%、20%、30%五個(gè)濃度組作用C6細(xì)胞24h后，篩選對(duì)C6細(xì)胞活力增強(qiáng)的最佳血藥濃度，并觀察細(xì)胞形態(tài)變化及Western Blot方法檢測(cè)相關(guān)蛋白TBP-2、TRX、RAGE、LRP1蛋白表達(dá)變化。
　　5、取最佳濃度LWDHS干預(yù)Aβ25-35作用AD細(xì)胞模型，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、活力及Western Blot方法檢測(cè)TBP-2、TRX、RAGE、

6、LRP1蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、用不同濃度Aβ25-35刺激C6細(xì)胞后，細(xì)胞活性及存活率顯著降低（P<0.05）。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：Aβ25-35刺激的C6細(xì)胞與正常C6細(xì)胞相比，隨著Aβ25-35劑量增高，C6細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞胞體縮小，突起變短，有細(xì)胞碎片出現(xiàn)和凋亡/死亡細(xì)胞逐漸增多，呈現(xiàn)劑量依賴性改變。蛋白表達(dá)結(jié)果表明：TBP-2和RAGE蛋白表達(dá)明顯增加，與之相反的是TRX和LRP1的蛋白表達(dá)明顯呈降

7、低趨勢(shì)。
　　2、用不同濃度 LWDHS干預(yù) C6細(xì)胞后，細(xì)胞活性及存活率顯著升高。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，隨著 LWDHS濃度增高，C6細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞聚集融合成單層，細(xì)胞的胞突明顯變大，突起數(shù)目增多，突起增粗增長(zhǎng)。同時(shí)觀察LWDHS20%、30%濃度組，胞體變大，數(shù)目不再增多，呈分化趨勢(shì)。Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：TBP-2、RAGE隨著血藥濃度的增加蛋白表達(dá)明顯降低；而 TRX、LRP1的蛋白表達(dá)隨著血藥

8、濃度的增加而增加，均成劑量依賴。
　　3、 LWDHS預(yù)刺激能夠抑制 Aβ25-35引起的細(xì)胞存活率下降，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：與正常對(duì)照組相比，Aβ25-35組 C6細(xì)胞細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞突起變短，有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)；LWDHS干預(yù)組凋亡細(xì)胞減少，細(xì)胞胞體增大，突起增長(zhǎng)。LWDHS抑制 Aβ25-35誘導(dǎo) TBP-2和RAGE蛋白表達(dá)的增加，恢復(fù)了降低的TRX和LRP1表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1、 Aβ25-35對(duì)C6細(xì)胞

9、毒性損傷與劑量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，對(duì)C6細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞增殖活性抑制效應(yīng)；Aβ25-35通過對(duì)TBP-2、TRX、RAGE、LRP1的表達(dá)調(diào)節(jié)，參與啟動(dòng)致病過程。在此過程中，胰島素信號(hào)和PI3K/AKT通路有可能參與了阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制。表明氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在 Aβ導(dǎo)致阿爾茨海默病發(fā)生中起著重要作用。
　　2、 LWDHS可能通過調(diào)節(jié)TBP-2、TRX、RAGE和LRP1表達(dá)Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用；