蛋白激酶抑制劑的篩選與活性化合物的分子藥理學(xué)研究.pdf

1、可逆性的磷酸化是細(xì)胞分裂受到精密調(diào)控的一個(gè)基本分子機(jī)制。已經(jīng)證實(shí)蛋白激酶家族，如周期依賴性激酶(CDKs)、保羅樣激酶(PLKs)和極光激酶(AURKs)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控起著重要作用。在哺乳動(dòng)物中，保羅樣激酶家族由四個(gè)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成，它們有不同的亞細(xì)胞定位和功能，其中PLK1在細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)中發(fā)揮著最重要的作用，研究的最為深入。人類的極光激酶家族包括三個(gè)成員AuroraA、B和C，在有絲分裂中和其他蛋白協(xié)同發(fā)揮作用。

2、這兩個(gè)激酶家族都和癌癥產(chǎn)生密切相關(guān)，被視為抗癌藥物的潛在有力的靶點(diǎn)。
　　 為了更有效地篩選具有抗腫瘤作用的激酶抑制劑，本研究利用分子生物學(xué)方法，從Hela細(xì)胞中提取總RNA，再通過RT-PCR及PCR手段，得到AuroraA和PLK1編碼基因(AURKA、PLK1)的克?。灰匀祟惒G丸組織的cDNA為模板得到AuroraC編碼基因(AURKC)的克隆，連接到pMD-18T載體，構(gòu)建了克隆質(zhì)粒。再將此片斷連接至表達(dá)載體pET-30

3、a-c(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化宿主菌E.ColiBL21。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后通過N12+柱親合層析對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得了比較高純度的重組AuroraA、AuroraC和PLK1激酶。為構(gòu)建三種激酶抑制劑的生化篩選模型奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究還以酵母保羅樣激酶CDC5蛋白的溫度敏感型突變株為模式菌，應(yīng)用96孔微板培養(yǎng)澄清度觀察法(微板培養(yǎng)法)累積篩選了3000份發(fā)酵液和3192個(gè)化合物，篩選得到1個(gè)β-咔啉堿類陽性

4、化合物DH166。在10μg/ml濃度下與野生型菌株相比cdc5-2突變型菌株對(duì)DH166表現(xiàn)出更高的敏感性，生長受到抑制，野生型酵母卻能正常生長；應(yīng)用酶聯(lián)免疫標(biāo)記法檢測DH166的體外PLK1抑制活性，結(jié)果顯示DH166能夠以競爭型抑制的方式抑制PLK1的活性；應(yīng)用MTT法檢測DH166對(duì)于HepG2、A549細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)DH166能夠抑制這兩種細(xì)胞的增殖；通過流式細(xì)胞儀檢測DNA含量研究DH166對(duì)于酵母和腫瘤細(xì)胞周期的影響，結(jié)

5、果發(fā)現(xiàn)DH166可以將酵母和A549細(xì)胞阻滯在G2/M期；利用AnnexinV-FITC/PI、Hochest33342染色法發(fā)現(xiàn)DH166能誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡；應(yīng)用流式細(xì)胞儀研究DH166對(duì)A549細(xì)胞中CyclinB1隆解的影響，發(fā)現(xiàn)DH166能抑制CyclinB1蛋白的降解；利用計(jì)算機(jī)輔助Dockingmodel顯示DH166進(jìn)入PLK1的激酶活性中心并占據(jù)ATP所在位置；利用酵母模型和MTT法對(duì)13個(gè)DH166同系物的生物活