利用RNA干擾技術雙通道抑制弓形蟲嘌呤補救合成途徑.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種單細胞原蟲，能侵犯包括人類在內(nèi)的幾乎所有溫血動物有核細胞，其感染所致的弓形蟲病是世界范圍的嚴重機會致病性寄生蟲病。我國弓形蟲血清陽性率約為7.88％，但是隨著人們飲食習慣及行為方式的改變，弓形蟲感染率在我國正呈上升的趨勢，其感染所帶來的危害正受到越來越多人的關注。弓形蟲感染也是引起家畜(例如家豬)死亡的常見病因之一，從而導致養(yǎng)殖業(yè)減產(chǎn)。因此本病是常見的人獸共患寄生蟲病。目前對于弓形蟲

2、病的治療仍以磺胺嘧啶(SDZ)和乙胺嘧啶(Pyrimethamine)的聯(lián)合使用作為首要選擇。但這種治療方式存在明顯的局限性，因為磺胺類藥物只能抑制增值狀態(tài)的速殖子，而對相對靜止和潛伏狀態(tài)的包囊和緩殖子效果較差。該類藥物還存在一系列毒副反應。因此尋求新的藥物治療靶標及新的治療手段仍是弓形蟲病防治的當務之急。 RNA干擾是近年興起的一項快速、簡便、高效地抑制基因表達的新技術，已成為基因功能研究、基因治療和尋找藥物靶點的重要工具。該

3、技術己從線蟲的研究拓展到各種生物。然而，遺憾的是，弓形蟲作為頂復門重要的模式生物，相關研究卻鮮有報道。對于低等生物，RNA干擾始于長片段dsRNA的降解，直接轉(zhuǎn)染長片段dsRNA就可以特異抑制目的基因的表達。而對于哺乳動物細胞，通常采取的策略是直接轉(zhuǎn)染小干擾RNA分子(siRNA)以避免長片段dsRNA在細胞內(nèi)誘發(fā)的非特異性基因抑制。這兩種分子(長片段dsRNA及siRNA)是否能在弓形蟲體內(nèi)抑制目的基因的表達、運用這兩種基因表達調(diào)節(jié)工

4、具雙通道抑制弓形蟲嘌呤代謝途徑中兩個關鍵酶后是否能有效抑制弓形蟲的增殖，上述問題是本研究擬解決的關鍵問題。 本研究以嘌呤補救合成途徑中的關鍵酶一AK和HXGPRT編碼基因為靶標，采用體外轉(zhuǎn)錄長片斷dsRNA及化學合成siRNA兩種不同的分子分別轉(zhuǎn)染弓形蟲速殖子。根據(jù)基因轉(zhuǎn)錄表達結(jié)果，闡明長片斷dsRNA及siRNA對弓形蟲體內(nèi)基因表達的影響。在此基礎上，雙通道下調(diào)弓形蟲嘌呤代謝途徑中這兩個關鍵酶，觀察對蟲體增殖的抑制情況及其在小

5、鼠體內(nèi)的毒力改變情況，進一步探討在弓形蟲感染中其作為治療工具的可能性，為開發(fā)新的抗弓形蟲藥物及新的治療方法奠定基礎。 1.長片斷dsRNA在弓形蟲體內(nèi)對目的基因的抑制在電轉(zhuǎn)后24h，檢測到4μg.AK dsRNA轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)AK mRNA水平明顯降低(P<0.05)，相對表達值為0.34±0.13。而8μg及12μg AK dsRNA轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)AKmRNA的相對表達值分別為0.97±0.25，1.15±0.02，與模擬電轉(zhuǎn)

6、弓形蟲相比差異沒有顯著性(P>0.05)。酶活性檢測結(jié)果顯示，4μg AK dsRNA轉(zhuǎn)染弓形蟲AK酶活性在轉(zhuǎn)染后24h開始降低，但與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲相比差異沒有顯著性。在轉(zhuǎn)染后48h，AK酶活性為模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲的0.56±0.15倍(P<0.05)。其他兩個劑量組沒有檢測到顯著降低的AK酶活性。 HXGPRT dsRNA電轉(zhuǎn)后對HXGPRT mRNA水平影響的規(guī)律與AK dsRNA對相應mRNA的影響相似。轉(zhuǎn)染后24h，4μg

7、HXGPRT dsRNA轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)HXGPRT mRNA的相對表達值為0.33±0.16，與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲相比差異有顯著性(P<0.05)。而8μg及12μg HXGPRT dsRNA轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)HXGPRT mRNA的相對表達值分別為0.80±0.19，0.90±0.27，與校準樣本相比差異沒有顯著性。HXGPRT酶活性檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后48h，4μg HXGPRT dsRNA電轉(zhuǎn)弓形蟲[3H]一次黃嘌呤攝入量與模擬電轉(zhuǎn)弓形

8、蟲相比明顯降低(P<0.05)，酶活性相對值為0.59±0.02。而8μg和12μg HXGPRT dsRNA電轉(zhuǎn)弓形蟲的HXGPRT酶活性沒有發(fā)生明顯降低(P>0.05)。LacZ dsRNA轉(zhuǎn)染不能降低弓形蟲體內(nèi)AK與HXGPRT的mRNA水平及酶活性。 2.長片斷dsRNA雙通道抑制AK及HXGPRT對弓形蟲增殖速率的影響在感染宿主細胞后24h、30h及42h，AK及HXGPRT長片段dsRNA聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲的平均倍增次數(shù)

9、分別為1.85±0.97，2.62±1.00，4.27±1.07，與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲組的平均倍增次數(shù)相比均明顯減少(P<0.05)。這表明dsRNA聯(lián)合干擾弓形蟲后，其增殖速率明顯放慢。在感染后24h，流式細胞術檢測結(jié)果顯示dsRNA聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲組的感染率為29％，而模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲組的感染率為40％。 3.siRNA在弓形蟲體內(nèi)對目的基因的抑制在針對AK編碼基因設計的三對25nt的siRNA中，有兩對(siRNA786,siRN

10、A1200)能明顯降低AKmRNA水平及酶活性，且抑制效率呈劑量依賴性。在感染后24h，21aM及41aM siRNA786電轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)的AK mRNA有明顯降低(P<0.05)，其相對值分別為0.59±0.08，0.47±0.13，而1μM siRNA786電轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)的AK mRNA與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲相比沒有明顯降低。4μMsiRNA1200電轉(zhuǎn)弓形蟲體內(nèi)的AK mRNA水平為模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲的0.52±0.19倍(P<0.05

11、)。AK酶活性檢測結(jié)果顯示，在感染后24h，2μM及4μM電轉(zhuǎn)弓形蟲的[3H]-腺苷攝入與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲組相比有明顯降低(P<0.05)，酶活性相對值分別為0.45±0.19，0.39±0.11。而4μM siRNA1200電轉(zhuǎn)染弓形蟲體內(nèi)AK酶活性與模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲相比也有明顯降低(P<0.05)。 在針對HXGPRT編碼基因設計的三對21nt的siRNA中，只有一對(siRNA415)能明顯降低HXGPRT mRNA水平及酶活

12、性。在轉(zhuǎn)染后24h，4μM siRNA415電轉(zhuǎn)弓形蟲的HXGPRT mRNA水平及[3H]一次黃嘌呤攝入量分別降為模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲的0.36±0.04及0.51±0.03倍(P<0.05)。 4.siRNA雙通道抑制AK與HXGPRT對弓形蟲增殖及感染能力的影響在感染宿主細胞后24h，4gM的siRNA786和siRNA415聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲、磺胺嘧啶處理弓形蟲及模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲的平均倍增次數(shù)分別為：1.64±0.95、1.04±0.88及

13、2.32±0.90，前兩組與后者相比倍增次數(shù)明顯減少(P<0.05)。在感染后40h，siRNA聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲及磺胺嘧啶處理弓形蟲的平均倍增次數(shù)分別為3.00±1.04，2.56±1.04，與模擬電轉(zhuǎn)染組相比(3.60±0.80)差異有顯著性(P<0.05)。 為進一步探討弓形蟲AK及HXGPRT被同時抑制后在小鼠體內(nèi)的毒力，將28只小鼠隨機分成4組，每組7只。模擬電轉(zhuǎn)組：模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲感染小鼠；SDZ處理組：模擬電轉(zhuǎn)弓形蟲感染

14、小鼠后連續(xù)7天SDZ灌胃(200mg/kg/d)；siRNA處理組：小鼠感染siRNA786及siRNA415聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲；SDZ&siRNA聯(lián)合干預組： siRNA786及siRNA415聯(lián)合電轉(zhuǎn)弓形蟲感染小鼠后連續(xù)7天SDZ灌胃(200mg/kg/d)。結(jié)果表明，在20天的觀察時間內(nèi)，模擬電轉(zhuǎn)組、SDZ處理組、siRNA處理組及SDZ&siRNA聯(lián)合干預組小鼠的平均存活天數(shù)分別為：7.14±0.37，8.85±1.34， 8.14

15、±1.34，10.83±4.67天，與前者相比，SDZ處理組及siRNA處理組小鼠的存活天數(shù)雖然有所延長但差異沒有顯著性，而SDZ&siRNA聯(lián)合干預組小鼠的存活天數(shù)差異有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論： (1)體外轉(zhuǎn)錄長鏈dsRNA在弓形蟲體內(nèi)能抑制目的基因的表達； (2)25nt及21nt的siRNA在弓形蟲體內(nèi)能特異性抑制目的基因的表達； (3)弓形蟲嘌呤代謝途徑中的關鍵酶--AK和HXGPRT被體外