苯造血毒性與惡性轉(zhuǎn)化作用機(jī)制研究.pdf

1、苯是環(huán)境中普遍存在的確定人類致癌物。長期吸入能引起機(jī)體多器官毒性及貧血、MDS和血液系統(tǒng)惡性腫瘤如白血病等不同的疾病。苯的毒性作用主要來自于體內(nèi)形成的代謝產(chǎn)物，其中1，4-苯醌是確定的致白血病物質(zhì)。本課題圍繞苯造血毒性與惡性轉(zhuǎn)化作用機(jī)制開展動物實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞研究。首先建立了苯對小鼠的亞慢性染毒模型，研究苯對小鼠的亞慢性毒性作用、對造血系統(tǒng)的毒性損傷作用，以及苯致骨髓細(xì)胞中Wnt、Notch、Hh等信號通路變化與造血毒性的關(guān)系，以探討苯致造血

2、系統(tǒng)毒性的機(jī)制。課題的第二部分則在檢測苯及1，4-苯醌對人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)毒性作用的基礎(chǔ)上，研究1，4-苯醌對HELF細(xì)胞的凋亡效應(yīng)與機(jī)制，以及惡性轉(zhuǎn)化作用與可能的分子機(jī)制。
　　一、亞慢性苯暴露對小鼠造血毒性及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究
　　本研究以玉米油溶劑、低劑量(300 mg/kg)、高劑量(600 mg/kg)苯皮下注射分別染毒C3H小鼠，5次/周，持續(xù)3個月，染毒結(jié)束后繼續(xù)觀察3個月。通過一般情況觀察、血常規(guī)、

3、體重及臟器系數(shù)、組織病理學(xué)檢查等研究苯對C3H小鼠的亞慢性毒性。結(jié)果表明，苯染毒初期，對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)具有興奮效應(yīng)，隨染毒時間延長，逐漸轉(zhuǎn)為神經(jīng)抑制；苯亞慢性染毒影響小鼠正常生長，降低外周血中紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)目，使小鼠發(fā)生貧血，抑制骨髓和脾臟造血，并且對小鼠肝臟、脾臟、肺、骨髓造成不同程度的損害作用。
　　苯亞慢性染毒對小鼠造血系統(tǒng)的毒性則通過血常規(guī)、骨髓象檢查(骨髓涂片)、骨髓切片病理學(xué)檢查、骨髓中造血干細(xì)胞比例、造血集落形成實(shí)驗(yàn)

4、進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，苯亞慢性染毒能影響外周血血象，抑制骨髓重建紅系及粒-巨噬細(xì)胞系造血能力，降低LKS干細(xì)胞在未分化成熟骨髓細(xì)胞(Lin-)中的比例，對骨髓造血干細(xì)胞的造血功能表現(xiàn)出一定程度的抑制。
　　通過熒光定量PCR檢測骨髓單個核細(xì)胞中Wnt信號通路β-catenin、c-Myc基因，Notch信號通路Notchl、CyclinDl基因，Hh信號通路的Bmil、P53基因的表達(dá)情況來探討三條信號通路與苯造血毒性的關(guān)系。結(jié)果顯

5、示，Wnt信號通路中的c-Myc在高劑量組中表達(dá)顯著升高；染毒組Notchl通路和Hh通路中的下游基因CyclinDl、P53基因較對照組表達(dá)量增加，但沒有顯著性差異。以上結(jié)果顯示，苯亞慢性染毒小鼠可能導(dǎo)致Wnt通路基因的改變，c-Myc基因的高表達(dá)是可能是造血異常的機(jī)制之一。由于以上信號通路是造血干細(xì)胞更新與分化的關(guān)鍵信號通路，因此提示我們在骨髓單個核細(xì)胞的研究基礎(chǔ)上應(yīng)進(jìn)一步探討上述信號通路在造血干細(xì)胞中的變化。
　　二、苯及1

6、，4-苯醌對HELF細(xì)胞的毒性作用與機(jī)制研究
　　以MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)來研究苯及1，4-苯醌對HELF細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果表明，苯和1，4-苯醌可以抑制HELF細(xì)胞生長，影響細(xì)胞周期分布并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過彗星實(shí)驗(yàn)、微核試驗(yàn)來觀察1，4-苯醌對HELF細(xì)胞的致遺傳毒性，并用RT-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平以探討其凋亡機(jī)制。彗星及微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以0、10、20、40、80μm

7、ol/L，的1，4-苯醌對HELF細(xì)胞進(jìn)行染毒，1，4-苯醌對HELF細(xì)胞具有明顯的遺傳毒性，并可致Bax、Bcl-2、P53基因表達(dá)水平上調(diào)。以40μmol/L1，4-苯醌染毒24、48、72h后，Bax、P53的相對表達(dá)水平隨著時間延長而上升，Bcl-2的相對表達(dá)水平隨著時間延長而下降，Bax/Bcl-2值隨著時間延長而增加。1，4-苯醌染毒使細(xì)胞P53，Bax/Bcl-2值增加，可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　以30μmol

8、/L，1，4-苯醌染毒5次后的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代以進(jìn)行惡性轉(zhuǎn)化。通過連續(xù)傳代，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)形態(tài)不規(guī)整，生長紊亂，體積變大，生長速度變緩等。而第1、5、10、15代時軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)和ConA凝集實(shí)驗(yàn)都顯示陰性結(jié)果，表明此時HELF細(xì)胞尚未發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。P53和c-Myc兩個基因在第1～5代時都呈現(xiàn)表達(dá)上升趨勢，但在第5～15代期間，表達(dá)量則隨傳代次數(shù)增加表現(xiàn)為緩慢下降，可能原因是在1～5代期間，1，4-苯醌對細(xì)胞產(chǎn)生了嚴(yán)重的DNA損傷，細(xì)胞