苯中毒的代謝特征與造血毒作用機(jī)制的研究.pdf

1、苯暴露可引起造血系統(tǒng)惡性腫瘤，苯造血毒性的分子機(jī)制迄今尚未完全闡明。研究苯暴露早期階段到苯造血毒性發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵事件及相關(guān)分子機(jī)制可以為苯中毒的診斷干預(yù)及早期預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。系統(tǒng)生物學(xué)研究顯示，機(jī)體細(xì)胞在生理病理不同狀態(tài)及疾病發(fā)生發(fā)展不同階段都具有特異性的代謝特征。本研究擬通過(guò)建立苯中毒小鼠模型，獲得小鼠外周循環(huán)及造血細(xì)胞的代謝特征，結(jié)合毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)結(jié)果分析特征性改變內(nèi)源性小分子物質(zhì)的相關(guān)代謝通路;進(jìn)一步研究苯造血毒性

2、相關(guān)的特異性代謝通路變化及作用機(jī)制;在此基礎(chǔ)上探討乙酰左旋肉堿干預(yù)是否影響苯暴露所致造血毒性、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激;最后初步探討了苯暴露對(duì)癌基因MDS-Evi1表達(dá)的影響以及該基因在造血干細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用機(jī)制。本研究分為五個(gè)部分：
　　第一章：苯中毒小鼠模型的建立及造血抑制毒性研究。使用C3H/He小鼠，苯暴露劑量為0、150及300 mg/kg·bw，皮下注射方式染毒，每天1次，連續(xù)5天，共染毒4周，構(gòu)建苯中毒小鼠模型，

3、模型構(gòu)建后進(jìn)行小鼠外周血常規(guī)、骨組織病理學(xué)、骨髓涂片、造血干細(xì)胞比例及造血集落形成能力檢查。結(jié)果顯示，通過(guò)皮下注射的染毒方式可成功構(gòu)建苯中毒小鼠模型，苯暴露對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)初期為興奮效應(yīng)，后期為抑制作用;苯暴露降低小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)，引起貧血，組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示苯引起小鼠骨髓和脾臟造血抑制，骨髓涂片可見(jiàn)苯組小鼠骨髓細(xì)胞形態(tài)及增生異常、原始細(xì)胞比例明顯增加;此外，苯暴露還可引起小鼠LSK細(xì)胞比例下降，造血干祖

4、細(xì)胞向GEMM和GM分化能力降低。以上結(jié)果表明苯暴露可引起小鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)降低、骨髓和脾臟造血抑制，骨髓細(xì)胞形態(tài)和增生分化異常;引起LSK細(xì)胞比例下降，GEMM和GM造血集落形成能力降低。
　　第二章：基于LC-MS研究苯暴露小鼠的代謝特征。使用LC/MS技術(shù)，研究苯暴露小鼠體循環(huán)（尿液、血漿）及靶器官（骨髓細(xì)胞）代謝特征，比較特異性內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物及其涉及的代謝通路;結(jié)合血液毒性評(píng)價(jià)及代謝特征，篩選潛在的尿液和血漿中標(biāo)志血

5、液系統(tǒng)早期損傷的代謝標(biāo)志物以及與苯造血毒作用相關(guān)的特異性代謝通路;此外，比較獲得在動(dòng)物模型骨髓細(xì)胞和血漿樣品中發(fā)現(xiàn)的共同差異代謝產(chǎn)物，在苯暴露人群血漿樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。成功建立基于LC-MS的小鼠尿液、血漿和骨髓細(xì)胞代謝組學(xué)分析平臺(tái)，結(jié)果顯示苯暴露擾亂尿液嘌呤、脂肪酸、色氨酸、谷?；奖彼岷蛠喚反x通路，干擾血漿色氨酸、組氨酸代謝、γ-谷氨酰循環(huán)、脂肪酸氧化以及脂肪酸代謝通路，導(dǎo)致骨髓細(xì)胞酪氨酸和苯丙氨酸代謝、賴氨酸分解、肉堿合成以及

6、脂肪酸氧化代謝通路紊亂;比較苯暴露小鼠血漿和骨髓細(xì)胞中的差異性代謝通路，發(fā)現(xiàn)脂肪酸β氧化通路中的代謝分子均檢測(cè)到一致的改變，在收集的正常人群、苯暴露對(duì)照人群及苯暴露血象異常人群血漿樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)苯暴露組人群血漿中左旋肉堿含量顯著下降，而乙酰左旋肉堿未發(fā)生明顯變化。以上結(jié)果提示苯暴露可干擾小鼠尿液、血漿和骨髓細(xì)胞中不同的代謝通路，其中，脂肪酸β氧化代謝通路是在外周樣本血漿及靶器官骨髓中的共同差異代謝通路，可能與苯造血毒性效應(yīng)密切相關(guān)

7、。
　　第三章：苯暴露對(duì)脂肪酸氧化代謝通路的影響及機(jī)制研究。將C3H/He小鼠暴露于0、20、40、80、160 mg/kg·bw苯，以皮下注射方式染毒，每天1次，連續(xù)5天，共染毒4周，檢測(cè)苯暴露對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞脂肪酸代謝通路關(guān)鍵酶mRNA水平和蛋白水平的影響，同時(shí)檢測(cè)對(duì)線粒體功能和氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果顯示，苯暴露可影響脂肪酸氧化通路中肉堿穿梭酶和β氧化關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)，蛋白水平的驗(yàn)證表明苯暴露可增強(qiáng)小鼠骨髓細(xì)胞肉堿穿梭蛋白Cpt

8、la和Crat的表達(dá)，使脂肪酸β氧化通路中Acaa2、Aldh1l2、Acadvl、Crot、Echs1和Hadha蛋白表達(dá)增加;苯暴露引起小鼠骨髓細(xì)胞中左旋肉堿、ATP和線粒體膜電位水平降低，同時(shí)還可引起H2O2、 MDA和ROS等氧化損傷指標(biāo)水平增高。以上結(jié)果提示苯暴露可影響脂肪酸氧化通路中肉堿穿梭及β氧化過(guò)程，引起線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激。
　　第四章：乙酰左旋肉堿干預(yù)對(duì)苯所致造血毒性的影響。使用100 mg/kg·bw和2

9、00 mg/kg·bw左旋乙酰肉堿干預(yù)150 mg/kg·bw苯暴露小鼠，觀察乙酰左旋肉堿對(duì)苯所致造血毒性、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果顯示，左旋乙酰肉堿對(duì)苯暴露導(dǎo)致的小鼠外周血細(xì)胞減少無(wú)明顯作用，但是200 mg/kg· bw左旋乙酰肉堿干預(yù)可以明顯增加苯暴露組小鼠全骨髓細(xì)胞數(shù)量、LSK造血干細(xì)胞比例和Lin-C-kit-Sca-1+造血祖細(xì)胞比例;乙酰左旋肉堿干預(yù)可以在一定程度上減輕苯所致的線粒體損傷，可降低苯暴露所致H2O

10、2、 MDA和ROS增加;200 mg/kg乙酰左旋肉堿干預(yù)可明顯降低苯暴露小鼠骨髓細(xì)胞尾部DNA含量、尾距和尾長(zhǎng)，減輕DNA損傷。以上結(jié)果提示乙酰左旋肉堿干預(yù)可在一定程度上減輕苯所致小鼠全骨髓細(xì)胞、LSK造血干細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能涉及減少苯暴露所致氧化應(yīng)激，降低苯誘導(dǎo)DNA損傷。
　　第五章：MDS-Evi1基因與苯毒性關(guān)系初探及其參與骨髓造血干細(xì)胞凋亡調(diào)控的研究。使用0、1μm、5μm和10μm1，4-苯醌染毒小鼠骨髓li

11、n-細(xì)胞24小時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及MECOM基因表達(dá)，同時(shí)在苯暴露小鼠骨髓細(xì)胞中檢測(cè)MECOM蛋白的表達(dá);隨后建立在ME表達(dá)細(xì)胞中特異性敲除Bax和Bak基因的MEm2小鼠，觀察LSK細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、集落形成能力以及競(jìng)爭(zhēng)性骨髓移植后LT-HSCs的重建能力。結(jié)果顯示，5μm和10μm1，4-苯醌組細(xì)胞存活率明顯下降，1μM1，4-苯醌組細(xì)胞的凋亡率最大;隨著染毒劑量的增加，細(xì)胞MECOM基因表達(dá)增加;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果