程序性細(xì)胞死亡因子PDCD4在前列腺癌中的表達(dá)分布、生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、在我國,前列腺癌占所有男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位[1]。前列腺癌發(fā)病隱襲,早期無典型癥狀,當(dāng)被人們發(fā)現(xiàn)時大多已是晚期。這使前列腺癌的早期預(yù)防和診斷顯得尤為困難。前列腺癌的早期診斷主要是根據(jù)血清中PSA的含量,此外直腸指診也是一個主要的輔助手段[2,3]。前列腺癌的臨床治療方法分為保守治療和主動性治療。主動性治療包括前列腺癌根治術(shù)、放射治療、試驗性前列腺癌局部治療和內(nèi)分泌治療。由于目前的臨床治療方法對中晚期前列腺癌的治療仍不是十分有

2、效,因此,近年來針對前列腺癌的基因治療受到了大家更多的關(guān)注,基因治療將為其提供新的突破[4]。人程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)是新近發(fā)現(xiàn)一個抑癌基因,在肝細(xì)胞癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤[5-7]中均檢測到PDCD4的mRNA及蛋白表達(dá)的減少甚至缺失,而且它與腫瘤病理分期及預(yù)后密切相關(guān)。以PDCD4為藥靶的基因治療方法有望在一定程度上實現(xiàn)對前列腺癌的有效控制。
　　目的:
　　1、觀察程序性細(xì)胞死亡因

3、子PDCD4在正常前列腺組織和不同分級前列腺癌組中的表達(dá)模式及分布情況,明確其是否能夠為分析前列腺癌患者病情進(jìn)展提供依據(jù)。
　　2、構(gòu)建并包裝過表達(dá)PDCD4分子的慢病毒表達(dá)系統(tǒng),利用該系統(tǒng)建立高表達(dá)PDCD4的前列腺癌細(xì)胞亞系,觀察其對前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響,進(jìn)而分析其對治療性藥物的藥物敏感調(diào)節(jié)作用。
　　3、探討PDCD4自身表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制,明確其可能的上游調(diào)控分子miR-155對其具有的負(fù)相調(diào)節(jié)作用。

4、　　方法:
　　1、對臨床手術(shù)收集到前列腺癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色,其中癌組織標(biāo)本為42例,癌旁增生組織標(biāo)本為12例。腫瘤的病理分級標(biāo)準(zhǔn)為:WHO分級結(jié)合Gleason評分系統(tǒng)。分級結(jié)果為:高分化癌(1-4分)9例,中分化癌(5-7分)14例,低分化癌(8-10分)19例,并進(jìn)行分析。
　　2、利用PCR擴(kuò)增PDCD4編碼區(qū)片段,克隆入pENTRA-3C入門載體,利用LRclonaseⅡ重組酶將目的基因片段轉(zhuǎn)接入pLenti-

5、6.3慢病毒表達(dá)載體并包裝相應(yīng)的慢病毒,以表達(dá)紅色熒光蛋白mCherry的pLenti-6.3-mCherry慢病毒載體包裝的慢病毒為對照,感染人前列腺癌DU145細(xì)胞,通過Blasticidin抗生素篩選出能夠穩(wěn)定過表達(dá)PDCD4蛋白的細(xì)胞亞株。利用Westernblot法檢測PDCD4蛋白的表達(dá)量,MTT法和平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力的變化。利用TRAIL檢測高表達(dá)PDCD4的前列腺癌細(xì)胞對化療藥物的藥物敏感情況。
　　

6、3、利用第二部分實驗中PCR擴(kuò)增的啟動子片段先克隆入T載體進(jìn)行測序,待測序正確后再克隆入報告基因載體。選用野生型海參熒光素酶報告基因載體pRL為內(nèi)參照與脂質(zhì)體2000載體組合共同轉(zhuǎn)染哺乳動物,48小時候后收集樣品并進(jìn)行熒光分析。利用miR-155的inhibitor和mimics轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞,觀察其對前列腺癌細(xì)胞自身的影響以及前列腺癌細(xì)胞對TRAIL的藥物敏感情況。
　　結(jié)果:
　　1、免疫組化結(jié)果。42例前列腺癌組織

7、中陽性表達(dá)率僅為30.95％(13/42),而癌旁增生組織中表達(dá)率為75.00%(8/12),前列腺癌組織中的PDCD4表達(dá)率明顯低于增生組織,對42例人前列腺癌組織中PDCD4的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示:PDCD4的表達(dá)與病理類型及組織學(xué)分級相關(guān)(P<0.05),與臨床TNM分期及Gleason評分密切相關(guān)(P<0.05)。
　　2、構(gòu)建了重組慢病毒載體pLenti6.3-PDCD4。利用重組慢病毒表達(dá)系統(tǒng)篩選穩(wěn)定過表達(dá)P

8、DCD4蛋白的細(xì)胞亞株,并用Westernblot法進(jìn)行了驗證。MTT法及平板克隆形成實驗結(jié)果顯示PDCD4高表達(dá)的DU145細(xì)胞亞株的增殖能力受到抑制,并提高了前列腺癌細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性。
　　3、發(fā)現(xiàn)PDCD4的上游有一個負(fù)向調(diào)控子—miR-155。抑制miR-155誘導(dǎo)了DU145細(xì)胞的自發(fā)凋亡并提高了DU145細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性。
　　結(jié)論:前列腺癌組織中PDCD4的表達(dá)明顯低于增生組織,

9、并隨著惡性程度的增加其表達(dá)量逐漸減少,可以看出PDCD4隨著腫瘤惡性程度的增高而呈現(xiàn)出低表達(dá)的趨勢,這個結(jié)果提示PDCD4在腫瘤的發(fā)展過程中有一定的作用,對于指導(dǎo)臨床治療方面有重要參考價值。我們成功構(gòu)建了表達(dá)PDCD4分子的慢病毒表達(dá)載體,篩選出穩(wěn)定表達(dá)PDCD4的DU145細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的PDCD4分子可以顯著抑制DU145前列腺癌細(xì)胞的增殖。我們還發(fā)現(xiàn)了PDCD4上游的一個負(fù)向調(diào)控子—miR-155;抑制miR-155之后能誘導(dǎo)