TPD52L2基因在前列腺癌中的表達(dá)和細(xì)胞功能學(xué)研究.pdf

1、背景及目的：前列腺癌(prostate cancer，PCa)是中、老年男性常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。隨著以前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)篩查代表的前列腺癌早期篩查技術(shù)在全球的推廣，近二十年來，前列腺癌的發(fā)病率不斷上升，最近的研究顯示，在全球男性癌癥中，前列腺癌的發(fā)病率和病死率已分別居第二位和第六位。在美國，前列腺癌的發(fā)病率位居男性惡性腫瘤之首，病死率僅次于肺癌，是40歲以上男性癌癥第二位死

2、因。近年來，隨著中國社會(huì)老齡化程度的加劇、國民健康體檢意識(shí)的增強(qiáng)以及腫瘤檢測技術(shù)的提高，伴隨人們居住環(huán)境和生活習(xí)慣的改變，前列腺癌的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢。因此，近年來針對前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制和臨床上如何早期診斷、治療、判斷預(yù)后的研究已經(jīng)成為全球泌尿外科的重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。
　　目前，以前列腺癌根治術(shù)為代表的手術(shù)切除方式是治療局限性前列腺癌最有效的方法之一，然而對于診斷為進(jìn)展期前列腺癌:高血清PSA值，高Gleason評分、

3、且發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，和局限性前列腺癌根治術(shù)后出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，首選治療方案是內(nèi)分泌治療。內(nèi)分泌治療又稱雄激素剝奪治療對雄激素依賴型前列腺癌療效確切，但雄激素剝奪治療中位有效時(shí)間僅為14-28月，幾乎所有患者最終都將發(fā)展為雄激素非依賴前列腺癌(AIPC)而對雄激素剝奪治療不敏感，對于這類病人，目前缺乏能有效控制病情的治療方案。
　　TPD52L2分子又稱TPD54/D54，是腫瘤蛋白家族D52(tumor protei

4、nD52,TPD52)的成員之一。TPD52家族是在研究乳腺癌中差異表達(dá)的基因時(shí)第一次被發(fā)現(xiàn)。該家族蛋白的特征結(jié)構(gòu)是N端具有相類似的雙股卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(coil-coiledmotif)。TPD52家族最重要的生理功能是參與Ca2+依賴的膜泡運(yùn)輸過程的調(diào)節(jié)。同時(shí)研究顯示，該家族成員蛋白在非精原細(xì)胞癌、精原細(xì)胞癌、導(dǎo)管和小葉型乳腺癌、肝細(xì)胞癌、口腔鱗癌等多種腫瘤組織中過量表達(dá)，提示TPD52家族可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。TPD

5、52L2作為家族的新成員，定位于20q13.2-q13.3。近年來，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞研究提示:敲減TPD52L2分子可以抑制細(xì)胞生長和克隆形成并將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。在口腔鱗癌細(xì)胞中，敲減TPD52L2同樣能抑制細(xì)胞生長并促進(jìn)凋亡，然而在前列腺癌組織和細(xì)胞中，關(guān)于TPD52L2的研究尚無人報(bào)道。
　　目的:探討TPD52L2在前列腺癌組織中的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系，及與已知臨床預(yù)后因素的相關(guān)性;建立TPD52L2表達(dá)沉默的激素非

6、依賴性前列腺癌細(xì)胞模型，研究TPD52L2對激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞功能和生物學(xué)行為的影響，并探索其可能發(fā)揮作用的分子機(jī)制。
　　方法、結(jié)果：
　　（一）前列腺癌臨床標(biāo)本TPD52L2表達(dá)水平檢測和患者預(yù)后分析我們收集了長征醫(yī)院泌尿外科2010-2012年117例接受前列腺癌根治術(shù)患者的臨床信息和組織標(biāo)本及術(shù)后隨訪信息。前列腺癌患者臨床信息包括患者診斷時(shí)年齡、術(shù)前PSA、術(shù)后病理分期、Gleason評分、病理T分期、包

7、膜侵犯、切緣陽性、周圍神經(jīng)侵犯和精囊侵犯等。所有腫瘤相關(guān)組織標(biāo)本分為癌和癌旁兩部分，每部分各分兩份分別放液氮和福爾馬林浸泡保存。術(shù)后隨訪信息包括生化復(fù)發(fā)時(shí)間。我們采用免疫組化、qPCR方法對所有組織標(biāo)本進(jìn)行TPD52L2表達(dá)水平檢測，并與患者臨床和預(yù)后信息做相關(guān)性分析，結(jié)果提示:相對于前列腺癌旁組織，前列腺癌組織中TPD52L2表達(dá)水平明顯升高，并與術(shù)后Gleason評分呈正相關(guān);生存分析提示:相對于TPD52L2高表達(dá)患者，低表達(dá)患者

8、無生化復(fù)發(fā)時(shí)間具有明顯優(yōu)勢。多因素分析提示:TPD52L2表達(dá)量、Gleason評分和病理T分期是前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　（二）構(gòu)建激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株TPD52L2敲減模型作為前期準(zhǔn)備工作，我們檢測了各種前列腺癌細(xì)胞系中TPD52L2的表達(dá)水平，確定相對高表達(dá)TPD52L2并且惡性程度較高的DU145和PC-3兩株細(xì)胞系作為我們的實(shí)驗(yàn)對象，并用已經(jīng)構(gòu)建好的靶向沉默TPD52L2基因的shRNA慢病毒對這兩

9、株前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行感染，觀察并記錄慢病毒自身熒光報(bào)告基因(GFP)表達(dá)情況，燃后分別利用qPCR技術(shù)和蛋白印記(western blot)對TPD52L2基因的敲減效率進(jìn)行mRNA和蛋白水平的檢測，結(jié)果提示shRNA慢病毒載體明顯下調(diào)了DU145和PC-3細(xì)胞中TPD52L2的表達(dá)。
　?。ㄈ┏聊琓PD52L2基因?qū)に胤且蕾囆郧傲邢侔┘?xì)胞株P(guān)C-3和DU145的增殖和克隆形成能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移能力的影響本實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，我們應(yīng)

10、用已構(gòu)建的TPD52L2穩(wěn)定下調(diào)的激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株模型，研究TPD52L2對激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞功能和生物學(xué)行為的影響。在已確定通過Lv-shRNA成功下調(diào)TPD52L2表達(dá)水平的PC-3和DU145前列腺癌細(xì)胞株中，進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。和對照組Lv-shCON轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，Lv-shTPD52L2轉(zhuǎn)染的兩株細(xì)胞系的生長明顯受到抑制、克隆形成能力下降、細(xì)胞遷移能力下降，差

11、異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且在DU145細(xì)胞系中，Lv-shTPD52L2轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)S期阻滯現(xiàn)象。
　　結(jié)論：通過以上實(shí)驗(yàn)，我們得出結(jié)論如下:TPD52L2在前列腺癌組織中過量表達(dá)，與Gleason評分呈正相關(guān)，并且是前列腺癌根治術(shù)患者術(shù)后生化復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素。進(jìn)一步體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示，沉默TPD52L2的表達(dá)可抑制激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的相關(guān)腫瘤生物學(xué)功能及特性，說明TPD52L2在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展及激素非依賴表型轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮重要