PCl-b-PEg-b-PCL聚合物載藥體系的構(gòu)建及抗腫瘤研究.pdf

1、惡性腫瘤已成為導(dǎo)致人類死亡的第二大原因，僅次于心血管疾病導(dǎo)致的死亡率?；瘜W(xué)治療是治療轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的重要手段之一。但傳統(tǒng)化療對(duì)腫瘤組織和細(xì)胞缺乏選擇性殺滅作用，常規(guī)治療劑量即可對(duì)正常組織器官產(chǎn)生顯著毒副作用，導(dǎo)致患者不能耐受，降低藥物療效。為了提高抗腫瘤藥物的靶向性和生物利用率，降低毒副作用，改善治療效果，納米藥物載體已成為腫瘤化療研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，其中代表性的給藥系統(tǒng)有脂質(zhì)體、納米粒、納米乳、聚合物膠束、聚合物囊泡等。
　　兩親性

2、聚合物能夠在不同條件下自組裝成聚合物膠束、聚合物囊泡等不同結(jié)構(gòu)的藥物載體。本文以具有良好生物相容性和可生物降解性的兩親性三嵌段共聚物—聚己內(nèi)酯-b-聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯(PCL-b-PEG-b-PCL)為載體材料，通過分子自組裝用不同親水/疏水鏈段的PCL-b-PEG-b-PCL分別研制出聚合物膠束和聚合物囊泡這兩種藥物載體，同時(shí)，進(jìn)一步研制出基于PCL-b-PEG-b-PCL的磷脂-聚合物雜化納米粒作為第三種藥物載體。以目前臨床使用

3、最廣泛的抗腫瘤藥物紫杉醇和阿霉素為模型藥物，研制載紫杉醇聚合物膠束、葉酸靶向載紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒、雙重載藥（親水內(nèi)腔載阿霉素、疏水雙分子膜層載紫杉醇）聚合物納米囊泡，研究其作為抗腫瘤藥物載體的有效性。
　　本文的主要研究內(nèi)容如下:
　　一、兩親性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL形成不同載體的研究
　　兩親性聚合物可以自組裝形成球狀膠束、柱狀膠束、蠕蟲狀膠束、聚合物囊泡等不同結(jié)構(gòu)，親水鏈段的質(zhì)量比或體

4、積比、共聚物分子量及制備方法是決定自組裝形成不同載體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵參數(shù)。對(duì)兩親性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL，目前尚無研究文獻(xiàn)報(bào)道其形成聚合物膠束和聚合物囊泡所需親水疏水嵌段比及分子量。本文合成了一系列質(zhì)量可控、結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確的不同分子量、不同比例親水疏水鏈段的聚合物，已經(jīng)初步確定了PCL-b-PEG-b-PCL聚合物自組裝形成囊泡的親水部分與疏水部分的比例及形成囊泡的規(guī)律。研究表明采用薄膜水化超聲分散法時(shí)，兩親性三嵌段共聚物PCL

5、-b-PEG-b-PCL(PCEP484)中PEG質(zhì)量百分?jǐn)?shù)約為50％時(shí)，能形成具有核-殼結(jié)構(gòu)的聚合物納米膠束;兩親性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL(PCEP888)中PEG質(zhì)量百分?jǐn)?shù)約為33％時(shí)，能形成具有明顯雙分子膜層結(jié)構(gòu)的聚合物囊泡。
　　二、載紫杉醇聚合物膠束的研制及其抗腫瘤研究
　　開發(fā)一種能有效在疏水性內(nèi)核包載抗腫瘤藥物紫杉醇(paclitaxel，PTX)的聚合物膠束藥物載體，并能用于靜脈全身給藥，

6、避免臨床紫杉醇注射劑使用聚氧乙烯蓖麻油作為增溶劑所引發(fā)的過敏反應(yīng)及毒副作用。本文以PCL-b-PEG-b-PCL(PCEP484)為載體材料，采用薄膜水化超聲分散法制備出可用于靜脈注射的載紫杉醇聚合物膠束(paclitaxel-loadedpolymericmicelles，PTX-PM)。掃描電鏡及透射電鏡顯示所研制的PTX-PM呈球形，大小均勻，具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)。紫杉醇依靠疏水作用有效載入疏水性鏈段PCL形成的疏水性內(nèi)核中，其載藥

7、量為28.98％，藥物包封率為94.36％，具有較高的載藥量與包封率。親水性PEG鏈段包裹在疏水性內(nèi)核外圍形成具有明顯冠狀結(jié)構(gòu)膠束表面，能使聚合物膠束能很好地分散于水相并具有長循環(huán)特性。載藥聚合物膠束的平均粒徑為93nm，多分散系數(shù)為0.19，非常有利于靜脈全身給藥。差示掃描量熱分析研究表明將紫杉醇制成緩釋納米粒后其結(jié)晶狀態(tài)發(fā)生了變化，以無定型狀態(tài)存在于聚合物膠束中。在1M水楊酸鈉中的體外釋放研究表明PTX-PM具有緩釋紫杉醇效果，無藥

8、物突釋，前5天為零級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)模型(R=0.99)。MTT法細(xì)胞毒性研究表明空白聚合物膠束對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞及EMT-6乳腺癌細(xì)胞均無毒性，在相同紫杉醇含量下，PTX-PM的細(xì)胞毒性低于市售紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑(Taxol(@))，并具有時(shí)間和劑量依賴性，說明紫杉醇包封于聚合物膠束中后其活性并沒有降低，而且可以隨著紫杉醇從聚合物膠束中逐漸釋放出來而在更長的時(shí)間內(nèi)作用于癌細(xì)胞。大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，與Taxol(@)相比，所研

9、制的載藥聚合物膠束明顯延長了紫杉醇在血液中的循環(huán)時(shí)間及消除半衰期，顯著提高了生物利用度。體內(nèi)抗腫瘤活性研究表明，PTX-PM對(duì)小鼠EMT-6乳腺癌具有明顯抑制作用，相同給藥劑量下其抑瘤效果優(yōu)于Taxol(@)（腫瘤抑制率:85.79％vs63.37％，p＜0.05）。上述研究表明所研制的PTX-PM高效低毒，能明顯延長紫杉醇在血液中的循環(huán)時(shí)間，具有EPR被動(dòng)靶向作用，是一種有潛力的可用于腫瘤治療的紫杉醇緩控釋載藥體系。
　　三、葉

10、酸靶向載紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒的研制及其抗腫瘤研究
　　磷脂-聚合物雜化納米粒(lipid-polymerhybridnanoparticles，LPNPs)是一類基于脂質(zhì)體和聚合物納米粒發(fā)展的新型藥物載體，本文開發(fā)了一種新型具有葉酸靶向的載紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒(PTX-FLPNPs)。以兩親性共聚物PCL-b-PEG-b-PCL(PCEP484)、甲氧基聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)及偶

11、聯(lián)葉酸的聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG(2000)Folate)為載體材料，通過薄膜水化超聲分散法制備出以葉酸為靶向的載紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒(PTX-FLPNPs)。透射電鏡顯示PTX-FLPNPs呈球形，大小均勻，具有“核-殼-殼”的結(jié)構(gòu)，疏水性鏈段PCL及藥物PTX通過自組裝形成內(nèi)核結(jié)構(gòu)，磷脂的DSPE形成內(nèi)層殼結(jié)構(gòu)，兩親性共聚物及磷脂中的親水性鏈段PEG形成外層殼結(jié)構(gòu)。激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步確證了所制備的羅

12、丹明標(biāo)記磷脂PTX-FLPNPs具有“核-殼-殼”的結(jié)構(gòu)及明顯的磷脂單分子層結(jié)構(gòu)。粒徑分析表明，PTX-LPNPs（無葉酸靶向分子）與PTX-FLPNPs（葉酸靶向）都具有較小的分散系數(shù)，表明采用該方法能制備出均一粒徑的磷脂-聚合物雜化納米粒。與PTX-LPNPs粒徑及zeta電位相比，PTX-FLPNPs的平均粒徑略有所增大(279.9nmvs271.5nm)，具有更高的負(fù)zeta電位值(-17.5mVvs-14.2mV)，間接表明了

13、FLPNPs外殼具有葉酸靶向分子。紫杉醇投藥量為30％時(shí)，PTX-FLPNPs和PTX-LPNPs的載藥量大于27％，藥物包封率大于90％，都具有較高的載藥量與藥物包封率。體外釋放研究表明，紫杉醇從PTX-FLPNPs和PTX-LPNPs中的釋放均具有緩釋效果，無明顯的藥物突釋。細(xì)胞吞噬的定性及定量研究結(jié)果表明，通過葉酸受體介導(dǎo)作用，靶向修飾的磷脂-聚合物雜化納米粒能有效進(jìn)入葉酸受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)。CCK8法細(xì)胞毒性研究表明空白FL

14、PNPs對(duì)H1299肺癌細(xì)胞及EMT-6乳腺癌細(xì)胞均無細(xì)胞毒性，在相同紫杉醇劑量下，PTX-FLPNPs與PTX-LPNPs的細(xì)胞毒性均低于Taxol(@)，而PTX-FLPNPs對(duì)細(xì)胞的殺傷力顯著高于PTX-LPNPs(p＜0.05)，進(jìn)一步說明通過葉酸的主動(dòng)靶向性，可提高藥物在腫瘤細(xì)胞中的濃度，有效殺傷腫瘤細(xì)胞。體內(nèi)抗腫瘤活性研究表明，采取瘤內(nèi)注射的方式，PTX-FLPNPs對(duì)小鼠EMT-6乳腺癌具有與紫杉醇注射劑類似的抑瘤效果(p

15、＞0.05)，但PTX-FLPNPs毒性低于紫杉醇注射劑。PTX-FLPNPs的抑瘤效果優(yōu)于PTX-LPNPs(65.78％vs48.38％，p＜0.05)，表明通過葉酸受體介導(dǎo)的靶向作用增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取進(jìn)而增強(qiáng)了抑瘤作用。
　　四、雙重載藥聚合物納米囊泡的研制及其腫瘤靶向初步研究
　　聚合物囊泡具有親水性內(nèi)腔及較厚的疏水性雙層膜，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)可以使其同時(shí)包載親水性及疏水性藥物，用于腫瘤的協(xié)同治療。本文以PCL-

16、b-PEG-b-PCL(PCEP888)為載體材料，采用薄膜水化超聲分散法制備出具有明顯雙分子膜層類似脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的聚合物囊泡。疏水性藥物紫杉醇(paclitaxel，PTX)依靠疏水性作用被包載進(jìn)入聚合物囊泡的疏水性膜層中，采用硫酸銨梯度法將親水性鹽酸阿霉素(doxorubicin，DOX)包載進(jìn)入聚合物囊泡的親水性內(nèi)腔中。透射電鏡表明雙重載藥聚合物囊泡(polymersomesloadedwithbothPTXandDOX,PS-PT

17、X-DOX)不但具有明顯的雙層膜層結(jié)構(gòu)，親水性內(nèi)腔由于DOX的載入還顯示出明顯的內(nèi)核。激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步確證帶有自發(fā)熒光的DOX載入親水性內(nèi)腔中。當(dāng)紫杉醇和阿霉素的投藥量為10％時(shí)，所研制的雙PS-PTX-DOX的平均粒徑為169.7nm，多分散系數(shù)為0.211，粒度較為均一，非常有利于作為全身給藥藥物載體用于腫瘤的聯(lián)合化療。細(xì)胞吞噬研究表明，在同樣的培養(yǎng)時(shí)間和阿霉素劑量下，PS-PTX-DOX在細(xì)胞核內(nèi)的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)小于阿霉素，表明