基于分子對接研究獨活寄生湯治療骨性關節(jié)炎的藥效物質(zhì)基礎及作用靶點.pdf

1、目的：
　　探討獨活寄生湯治療骨性關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的藥效物質(zhì)基礎與作用靶點。
　　方法：
　　1.從中藥原植物化學成分手冊、北京大學中草藥有效成分數(shù)據(jù)庫和文獻中，搜索獨活寄生湯化學成分，構建獨活寄生湯化學成分分子數(shù)據(jù)庫;通過Discovery Studio(DS)的分子對接平臺，選取已經(jīng)明確的OA治療靶點蛋白聚糖酶1(ADAMTS-4)、蛋白聚糖酶2(ADAMTS-5)、基質(zhì)金屬酶(MMP)

2、-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-11、MMP-13、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、人核因子κB抑制物激酶β(IKK-β)和5-脂氧合酶(5-LOX)為受體，對獨活寄生湯化學成分進行虛擬篩選，預測獨活寄生湯治療OA的藥效物質(zhì)基礎及作用靶點。
　　2.以獨活寄生湯治療OA的藥效物質(zhì)基礎為研究對象，借助DS軟件的定量構效關系和主成分分析平臺，描述其化學空間。通過與已經(jīng)批準治療OA的藥物比較，研究獨

3、活寄生湯治療OA的藥效物質(zhì)基礎化學空間特征;借助Cytoscape2.8.3軟件的網(wǎng)絡構建和分析平臺，構建獨活寄生湯藥效物質(zhì)基礎-靶點作用網(wǎng)絡和靶點-疾病網(wǎng)絡，研究獨活寄生湯藥效物質(zhì)基礎的作用網(wǎng)絡特征。
　　3.采用血清藥理學方法，將健康2月齡清潔級SD雄性大鼠36只，隨機分為生理鹽水組、壯骨關節(jié)丸組和獨活寄生湯組，每組各12只。分別給予相對應的給藥量灌胃7天，腹主動脈采血，制備含藥血清。
　　4.取4周齡清潔級SD大鼠的膝

4、關節(jié)軟骨組織，經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)軟骨細胞，采用甲苯胺藍染色法和Ⅱ型膠原免疫組化法鑒定第三代的軟骨細胞，作為后續(xù)的實驗用。
　　5.選取5個獨活寄生湯治療OA的預測靶點為研究對象，以IL-1β誘導的退變軟骨細胞為模型，借助血清藥理學和蛋白印跡平臺，將第3代軟骨細胞分為空白對照組、模型組（IL-1β+生理鹽水血清）、治療組1（IL-1β+獨活寄生湯組血清）和治療組2(IL-1β+壯骨關節(jié)丸血清)

5、，觀察各組中預測靶點的表達變化，以期進一步闡明獨活寄生湯治療OA的靶點，并對其機制做初步探討。
　　結果：
　　1.構建了含有566個化合物的獨活寄生湯化學成分分子數(shù)據(jù)庫;以ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-11、MMP-13、 COX-2、IKK-β和5-LOX為靶點，以原配體打分值為閾值，從獨活寄生湯化學成分分子數(shù)據(jù)庫中分別篩出與其結合較好

6、的化合物0、1、172、103、28、2、91、113、33、16、14、127和117個，視為獨活寄生湯的藥效物質(zhì)基礎。
　　2.化學空間特征研究結果顯示，獨活寄生湯藥效物質(zhì)基礎在分子量、氫鍵受體數(shù)目、氫鍵給體數(shù)目、脂水分配系數(shù)等描述符值的區(qū)間比已批準OA治療藥物廣。而且，在化學空間上分布很分散，與藥物分子有較大的重疊。
　　3.網(wǎng)絡特征研究結果顯示，獨活寄生湯藥效物質(zhì)基礎對OA治療靶點的作用方式不是線性關系，即大部分化合

7、物只能作用于1個靶點，僅少數(shù)的化合物能作用于多個靶點，而且，具有混雜藥物性質(zhì)的化合物占70％。藥效物質(zhì)基礎-靶點作用網(wǎng)絡在路中心、最近距離中心、平均最短路徑長度和拓撲系數(shù)統(tǒng)計上，具有較廣的分布。此外，靶點-疾病網(wǎng)絡顯示預測的12個獨活寄生湯作用靶點與18類疾病有關。
　　4.細胞鑒定結果顯示，細胞經(jīng)甲苯胺藍染色后呈異染性，Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色陽性，由此說明分離細胞為軟骨細胞。
　　5.Western blot結果顯示，與

8、空白對照組相比，模型組的MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2表達明顯上調(diào)(P＜0.01)。與模型組相比，治療組1和治療組2的MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2表達明顯下調(diào)(P＜0.05)。與治療組2相比，治療組1的MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2表達與治療組2無明顯差異（P＞0.05），但治療組1的MMP-1表達與治療組2有明顯差異(P＜0.01)。
　　結論：

9、r>　　1.獨活寄生湯的藥效物質(zhì)基礎包含了264個化合物，能作用于12個OA治療靶點。
　　2.通過定量構效關系和生物網(wǎng)絡平臺，直觀顯示了獨活寄生湯藥效物質(zhì)基礎的化學空間和網(wǎng)絡特征，揭示了其主要是通過混雜藥物的方式起作用，能用于治療包括OA在內(nèi)的多種疾病。
　　3.獨活寄生湯能顯著抑制IL-1β誘導的退變軟骨細胞中MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13和COX-2表達，驗證了分子對接預測獨活寄生湯治療OA的作用靶點