釀酒酵母Spc29p磷酸化對N-Sfi1p與Spc29p之間相互作用的影響.pdf

1、釀酒酵母釀酒酵母Spc29p磷酸化磷酸化對NSfi1p與Spc29p之間相互作用間相互作用的影響影響PreliminarystudyontheinvolvementofSpc29pphosphylationinregulatingtheinteractionbetweenNSfi1pSpc29pofSacomycescerevisiae學科專業(yè)：生物化工研究生：蒲琳指導教師：馬平生教授天津大學化工學院二零一二年五月中文摘要中文摘要在釀酒

2、酵母細胞中，紡錘體極體(spindlepolebodySPB)是它的微管組織中心，在維持細胞遺傳穩(wěn)定性上發(fā)揮著極其重要的作用，與高等動物細胞的微管組織中心即中心體有著很多同源的蛋白組分，高度保守和相似的復制和分離調(diào)控機制，已經(jīng)成為中心體復制與分離研究的模式細胞器。SPB由SPB主體和半橋兩部分組成。Sfi1p是SPB必需的半橋蛋白，缺失或突變會導致SPB復制失敗，對SPB正常功能的維持具有十分重要的作用，并且在人類中心體中也存在其同源蛋

3、白hSfi1p。Spc29p是構(gòu)成SPB中央斑塊的必需卷曲螺旋蛋白，是SPB主體蛋白組分，限制溫度下Spc29p的溫度敏感突變會導致SPB無法復制。實驗室前期的研究結(jié)果表明Spc29p與Sfi1p的N端之間存在強烈的相互作用，這對于早期的SPB的復制是非常重要的，第一次揭示了SPB主體和半橋之間有直接的聯(lián)系。Spc29p在4個磷酸化位點T18、T159、S187和T240處被蛋白激酶Mps1p磷酸化。本論文對Spc29p的磷酸化對其與N

4、Sfi1p之間相互作用的影響進行了初步研究，并進一步探討了Spc29p磷酸化對SPB自我組裝過程的影響。該研究為SPB復制過程的深入研究提供了科學指導，也對人類中心體的相關(guān)研究具有重要的借鑒意義。本文通過融合PCR、定點誘變技術(shù)及其他克隆手段對SPC29磷酸化位點處的基因序列進行修飾，構(gòu)建出處于消除磷酸化狀態(tài)的突變質(zhì)粒pGAD424spc29T18A、T159A、S187A和4A以及處于模擬磷酸化狀態(tài)的突變質(zhì)粒pGAD424spc29T

5、18D、T159D、S187D和4D，經(jīng)過測序分析正確，另外，包括實驗室收藏的質(zhì)粒pGAD424、pGBT9、pGAD424SPC29、pGBT9SPC29、pGBT9SFI1NT(1250)，及質(zhì)粒pGAD424spc29T240A、T240D。將攜帶有SFI1NT的BD載體pGBT9和攜帶有SPC29或spc29各等位基因的AD載體pGAD424共同轉(zhuǎn)化酵母菌PJ694a。通過酵母雙雜交實驗對Spc29p磷酸化機制對其與NSfi1p

6、之間相互作用的影響進行了初步研究。實驗結(jié)果顯示模擬磷酸化狀態(tài)的spc294D與SFI1NT的相互作用與消除磷酸化狀態(tài)的spc294A相比明顯降低，表明Spc29p的磷酸化對其與NSfi1p的結(jié)合有調(diào)節(jié)作用且為負調(diào)控，即Spc29p磷酸化降低了其與NSfi1p之間的親和力，削弱了兩者之間的相互作用，進一步影響了SPB主體與半橋之間的結(jié)合。因此，Spc29p磷酸化作用可能構(gòu)成了一種新型的調(diào)控酵母細胞SPB復制的作用機制。關(guān)鍵詞：釀酒酵母；紡