枯草桿菌兩步法生產(chǎn)四甲基吡嗪的調(diào)控及機制的研究.pdf

1、四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TTMP),又稱川芎嗪,是吡嗪環(huán)碳原子上均連接甲基的含氮雜環(huán)化合物。TTMP作為天然香料,具有烘烤、花生、榛子和可可香氣,可用于烘烤食品、冷飲、肉類、乳制品、飲料酒和卷煙等香精的調(diào)配;同時,TTMP是中藥材川芎(Ligusticum wallichii)根莖的主要活性生物堿成分,具有擴張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板集聚等作用,廣泛應用于臨床。
　　 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)TTMP的研

2、究起步較晚,相關(guān)文獻報道較少,且發(fā)酵體系中前體乙偶姻與氨反應生成TTMP的機制仍存在爭議。目前,鮮有大規(guī)模TTMP發(fā)酵生產(chǎn)的工業(yè)化應用實例,其原因主要為TTMP產(chǎn)量較低、前體乙偶姻的有效轉(zhuǎn)化率不高(＜1％)、外源添加的乙偶姻存在產(chǎn)物抑制現(xiàn)象且乙偶姻和TTMP均對細胞具有毒性等。因此,開發(fā)具有優(yōu)良特性的TTMP生產(chǎn)菌株、研究微生物利用葡萄糖代謝產(chǎn)生乙偶姻以及乙偶姻和氨反應生成TTMP的機制、并基于不同產(chǎn)生機制建立合適的TTMP生產(chǎn)工藝是提

3、高微生物發(fā)酵生產(chǎn)TTMP的有效手段,為工業(yè)化應用奠定基礎(chǔ)。
　　 本文以獲得高產(chǎn)TTMP菌株為目標,首先建立了一種內(nèi)源前體篩選策略,從醬香型高溫大曲中獲得一株高產(chǎn)TTMP的菌株Bacillus subtilis XZ1124;根據(jù)其在不同培養(yǎng)條件下的發(fā)酵動力學分析,建立相應的發(fā)酵策略;對發(fā)酵體系中TTMP的生成機制進行探索,并基于實驗結(jié)果建立有效的微生物發(fā)酵偶聯(lián)TTMP合成工藝;同時,利用發(fā)酵結(jié)束廢棄的菌體作用生物催化劑,建立枯

4、草桿菌多步轉(zhuǎn)化葡萄糖生成乙偶姻的工藝及其偶聯(lián)化學合成生產(chǎn)TTMP的工藝,具體內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 (1)基于前體乙偶姻和TTMP分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性,建立了一種適合于風味化合物TTMP篩選的內(nèi)源前體篩選策略;并應用該策略,從醬香型高溫大曲中獲得一株TTMP產(chǎn)生菌XZ1124,該菌株能利用葡萄糖代謝產(chǎn)生大量前體乙偶姻,從而有效促進了TTMP的合成;根據(jù)菌落、細胞形態(tài)特征和生理生化特性以及16S rDNA序列分析,將該菌株鑒定為枯草桿

5、菌(Bacillus subtilis);通過單因素優(yōu)化,確定了最優(yōu)的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件:蔗糖100g/l、豆餅粉40g/l、酵母膏5g/l、磷酸氫二銨30g/l、初始pH7.5、裝液量50/250 ml、搖床轉(zhuǎn)速200 rpm、培養(yǎng)溫度37℃;在此條件下,B.subtilis XZ1124搖瓶培養(yǎng)120 h,TTMP產(chǎn)量達4.08g/l,前體乙偶姻積累量在培養(yǎng)66 h時達到峰值(22.3g/l),前體的有效利用率達23.7％,遠高于

6、文獻報道值(1％)。
　　 (2)根據(jù)不同pH控制下發(fā)酵罐培養(yǎng)的動力學分析,建立了適合于枯草桿菌TTMP發(fā)酵的兩階段pH控制策略,通過控制培養(yǎng)前期的發(fā)酵液為弱酸性,保證細胞的快速增殖和前體乙偶姻的大量積累,培養(yǎng)后期調(diào)節(jié)發(fā)酵液為中性,促進枯草桿菌轉(zhuǎn)化乙偶姻生成TTMP(7.43g/l);根據(jù)枯草桿菌在7.5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)時不同攪拌轉(zhuǎn)速下的動力學分析,結(jié)合發(fā)酵體系中前體乙偶姻和氨的化學反應特性,建立了多階段攪拌轉(zhuǎn)速偶聯(lián)溫度控制的發(fā)酵

7、策略:0～12 h,控制培養(yǎng)溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為700 rpm,12～48 h,控制培養(yǎng)溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為500.rpm,48～120 h,控制培養(yǎng)溫度55℃、攪拌轉(zhuǎn)速為500 rpm,該發(fā)酵策略可有效促進前體乙偶姻的大量積累,發(fā)酵結(jié)束時TTMP的產(chǎn)量達7.12g/l,比恒溫(37℃)和恒定攪拌轉(zhuǎn)速(500 rpm)培養(yǎng)時分別提高了38.5％和25.1％;根據(jù)不同初始葡萄糖濃度下的發(fā)酵動力學分析,建立了葡萄糖補加策略:初始葡萄糖濃

8、度為80g/l、培養(yǎng)36 h補加50g/l葡萄糖,該補加策略有效提高了前體乙偶姻的積累量,發(fā)酵結(jié)束時前體乙偶姻的積累量達40.9g/l,與對照發(fā)酵相比提高了96.6％;TTMP濃度達6.54 g/l,比對照發(fā)酵提高了28.2％。
　　 (3)考察了不同銨鹽對枯草桿菌發(fā)酵產(chǎn)TTMP的影響,結(jié)果表明磷酸氫二銨(DAP)對TTMP合成的促進作用最為顯著,且NH4+和PO43-同時存在時該促進作用尤為突出;提高培養(yǎng)基中初始DAP的濃度(

9、或單獨提高NH4+和PO43-濃度)可有效促進發(fā)酵體系中TTMP的生成,然而,高濃度的NH4+和PO43-離子不利于細胞的增殖、糖的消耗以及前體乙偶姻的積累;基于細胞增殖、前體乙偶姻積累和產(chǎn)物TTMP合成過程對DAP需求的差異,提出DAP補加策略,并應用于枯草桿菌搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐培養(yǎng)過程,TTMP的最大生成速率分別提高了46.8％和76.8％,發(fā)酵結(jié)束時TTMP產(chǎn)量分別為9.10和7.34 g/l。
　　 (4)建立了酶促反應模

10、型體系,該模型體系為含有一定濃度乙偶姻和30 g/l磷酸氫二銨的溶液(pH7.0),通過向該模型體系中加入胞內(nèi)粗酶液和胞外粗酶液檢測TTMP的變化;并進一步應用原位反應體系驗證TTMP生成過程中的酶促催化反應,將枯草桿菌全細胞作為催化劑,考察了胞內(nèi)酶和胞外酶對體系中乙偶姻和氨反應生成TTMP的影響;結(jié)果表明,發(fā)酵體系中TTMP的合成過程不存在酶促催化反應;但枯草桿菌培養(yǎng)液中可能存在一種或多種小分子代謝物,該代謝物能夠促進乙偶姻和氨化學反

11、應合成TTMP。
　　 (5)考察了不同質(zhì)子供體對乙偶姻和氨反應生成TTMP的影響,磷酸鹽在pH7.01時主要以磷酸二氫根和磷酸一氫根共軛對形式存在,能夠提供足量的質(zhì)子參與乙偶姻和氨反應生成Schiff堿的過程,促進了TTMP的合成:通過考察糖代謝途徑中有機酸對枯草桿菌發(fā)酵體系中TTMP生成的影響,發(fā)現(xiàn)乳酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸和檸檬酸均可促進發(fā)酵體系中TTMP的生成;進一步考察了乙偶姻和DAP濃度、pH、溫度和攪拌條件以及供氧

12、條件對枯草桿菌原位發(fā)酵體系中TTMP和YTTMP/HB的影響,確定了最優(yōu)的TTMP合成條件,將100g/l乙偶姻和200g/l DAP的原位發(fā)酵體系于90℃、200 rpm的水浴搖床中反應8 h后,TTMP的產(chǎn)量達45.1 g/l;在此基礎(chǔ)上,建立了枯草桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻偶聯(lián)TTMP化學合成的工藝:在前體乙偶姻的積累階段,采用pH5.5的脅迫環(huán)境促進枯草桿菌的快速增殖和前體乙偶姻的大量積累;培養(yǎng)120 h后,控制反應條件為TTMP合成最

13、優(yōu)條件,反應結(jié)束時TTMP的濃度達16.8g/l,該結(jié)果驗證了枯草桿菌發(fā)酵生產(chǎn)前體乙偶姻偶聯(lián)TTMP化學合成工藝提高TTMP產(chǎn)量的有效性。
　　 (6)建立了枯草桿菌全細胞多步轉(zhuǎn)化葡萄糖生成乙偶姻的工藝,確定了最適的轉(zhuǎn)化條件:葡萄糖濃度140g/l,細胞濃度100g/l,以0.5 M的PBS緩沖(pH7.0)為反應介質(zhì),裝液量為20/50 ml,紗布密封,于35℃、150 rpm搖床中反應96 h;在上述條件下,枯草桿菌轉(zhuǎn)化體系