枯草桿菌脂肪酶固定化催化生產(chǎn)生物柴油的研究.pdf

1、目的: 將枯草桿菌脂肪酶分泌菌株產(chǎn)生的脂肪酶固定在人造沸石上，考察該固定方法的可行性，并對(duì)固定化酶的催化能力和催化條件進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估；對(duì)固定化酶催化合成生物柴油的工藝進(jìn)行探討，考察各影響因素對(duì)酯化率的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳轉(zhuǎn)酯反應(yīng)條件，以增加脂肪酶的利用率和催化效果，為實(shí)際運(yùn)用固定化酶催化生產(chǎn)生物柴油提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法: 本研究以枯草桿菌表達(dá)菌株產(chǎn)生的脂肪酶為材料，通過(guò)酶的粗分離后，采用交聯(lián)-吸附法將脂肪酶固定在人造

2、沸石上，使用p-NPP法通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定發(fā)揮該酶最大酶活的條件。以橄欖油作為催化底物，碳酸二甲酯為?；w使用該固定化酶催化制備生物柴油，考察了酶用量、醇油摩爾比、含水量、催化溫度、催化時(shí)間，以及不同的催化底物對(duì)催化過(guò)程的影響；建立正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采用高效液相色譜檢測(cè)法檢測(cè)轉(zhuǎn)化率的變化情況，運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酯交換工藝條件，定性、定量分析固定化酶催化生產(chǎn)生物柴油的最佳條件。
　　 結(jié)果:
　　

3、 1.采用交聯(lián)-吸附法固定枯草桿菌脂肪酶。使用硫酸銨分級(jí)沉淀法提取脂肪酶，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，以人造沸石作為酶的載體，戊二醛濃度3%時(shí)能達(dá)到最好的固定化效果。測(cè)得酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km=12.5μmol/L，Vmax=1.896μmol/ml/min。
　　 2.固定化酶酶學(xué)特性測(cè)定。對(duì)固定化脂肪酶和游離脂肪酶的溫度、pH值、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性進(jìn)行比較，結(jié)果表明固定化酶最佳反應(yīng)溫度為40℃，相對(duì)與游離酶提高5℃，最佳反應(yīng)pH值為8.

4、0，比游離酶提高0.5；熱穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)。連續(xù)反應(yīng)5個(gè)批次后酶活剩余78%。
　　 3.采用正交試驗(yàn)分析，結(jié)果表明在溫度50℃，pH8.0，反應(yīng)時(shí)間45min的條件下，固定化酶能夠發(fā)揮最高的酶活性。
　　 4.使用固定化酶進(jìn)行酶催化法制備生物柴油。HPLC作為測(cè)定酯化率的檢測(cè)方法，確定固定化酶的酯交換優(yōu)化條件為：醇油比4：1，酶用量為0.1g/g·oil，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間24h，再此條件下，酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達(dá)

5、到41.5%。
　　 結(jié)論:
　　 1.以人造沸石為載體戊二醛為交聯(lián)劑的交聯(lián)吸附法固定枯草桿菌脂肪酶是有效、可行的固定化方法。
　　 2.通過(guò)對(duì)酶學(xué)特性的測(cè)定，認(rèn)為固定后枯草桿菌脂肪酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均得到提高，并可重復(fù)使用，表現(xiàn)出了固定化酶的優(yōu)勢(shì)，符合制備固定化酶的目的。
　　 3.采用酶催化法合成出了生物柴油，用薄層層析法和高效液相色譜分析法可對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析，確定本方法確實(shí)可用于生