枯草桿菌新型表達系統(tǒng)和遺傳操作體系的建立及應用.pdf

1、枯草桿菌由于具有非致病性、分泌蛋白能力強的特性和良好的發(fā)酵基礎，是目前原核表達系統(tǒng)中表達和分泌外源蛋白較理想的宿主。但由于受自身分泌蛋白酶多、構建的重組表達質粒不太穩(wěn)定等因素影響，其應用受到一定的限制。近年來，隨著分子生物學和基因工程的發(fā)展，枯草芽孢桿菌作為基因工程表達系統(tǒng)發(fā)展迅速，并展現(xiàn)出良好的應用前景。本文旨在建立一套枯草桿菌高效表達和分泌系統(tǒng)，實現(xiàn)甲基對硫磷水解酶基因mpd在枯草桿菌中的高效表達和分泌，以解決其在原始菌株中表達存在

2、的一些問題；同時本文亦對枯草桿菌同源重組和載體轉化等遺傳操作體系進行了一些探索性研究。以mpd基因為報告基因，構建了一個新型的方便而高效的啟動子探針pUC-mpd。構建了枯草桿菌168的基因組DNA的啟動子文庫，利用啟動子探針從文庫中克隆了一系列啟動子功能片段并比較了其在大腸桿菌中的啟動子強度，得到了兩個克隆有強啟動子片段的克隆pMPDP3和pMPDP29。測定并分析了重組載體pMPDP3和pMPDP29克隆到的兩個強啟動子功能片段的序

3、列，分別為兩個功能未知基因ytkA和ywoF基因上游的啟動子，mpd基因分別與ytkA和ywoF基因的信號肽編碼序列發(fā)生了融合表達。對兩個啟動子的結構及兩個基因與MPH的融合表達產(chǎn)物進行了預測和分析。ytkA基因表達產(chǎn)物的信號肽為脂蛋白信號肽，而ywoF基因表達產(chǎn)物的信號肽為分泌型信號肽。利用大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體pNW33N與mpd基因構建了穿梭啟動子探針pNW33N-mpd。利用該探針釣取啟動子后可以不經(jīng)亞克隆而直接轉入枯草桿菌

4、測定和比較啟動子的強弱。利用穿梭啟動子探針重新克隆了ytkA和ywoF基因的啟動子與信號肽編碼序列，構建了mpd基因穿梭表達載體pNYTM和pNYWM。將載體pNYTM和pNYWM轉入枯草桿菌1A751重組表達mpd基因。發(fā)現(xiàn)在枯草桿菌中，ytkA基因的啟動子強度遠強于ywoF基因的啟動子。1A751(pNYTM)的mpd重組表達產(chǎn)物與細胞結合，而1A751(pNYWM)的mpd重組表達產(chǎn)物大部分分泌在發(fā)酵液上清中。利用ytkA基因的強

5、啟動子和nprB基因的分泌型信號肽重新構建了mpd基因的分泌表達載體pYNMK。將pYNMK轉入缺失了8種蛋白酶的枯草桿菌WB800，使mpd基因獲得了更高水平的分泌表達，91.4％的酶分泌在上清液中，表達量是出發(fā)菌株的10.8倍。進而利用PCR方法克隆和融合了P<,43>啟動子功能片段和nprB基因信號肽編碼序列，構建了新的大腸桿菌-枯草桿菌分泌表達載體pP43NMK。將pP43NMK導入到枯草桿菌WB800獲得表達菌株WB800(p

6、P43NMK)，在P<,43>啟動子的帶動下，mpd基因在表達菌株的對數(shù)生長期和穩(wěn)定期都得到了持續(xù)性高效表達和分泌。在培養(yǎng)到96 h后培養(yǎng)基中積累的MPH達到53 mg／mL，酶活為27.132 U／mL。表達量是原始菌株28．3倍，上清液中的酶活提高了約945.4倍。對重組表達的MPH進行了SDS-PAGE和酶譜分析，MPH在培養(yǎng)到96 h后有輕微的降解隨后保持穩(wěn)定，重組表達MPH具有天然活性。通過陰離子交換和電洗脫純化了MPH。通過

7、MALDI-TOF-MS測得的MPH的分子量與MPH的理論分子量基本吻合，為31.384 kDa。MPH經(jīng)HPLC-ESI-MS分析確認其N-末端的序列為AAPQVR，從而證明重組表達MPH的信號肽已經(jīng)被正確切割，MPH實現(xiàn)了天然N-末端表達。以短短小芽孢桿菌B15的總DNA為模板，利用PCR技術克隆到其細胞壁蛋白基因串聯(lián)啟動子和信號肽編碼序列，測序分析后提交至GenBank，登錄號為AY956423。重新設計引物擴增該片段并在PCR產(chǎn)

8、物兩側引入BamHI和PstI酶切位點，將PCR產(chǎn)物雙酶切后克隆至穿梭載體pP43NMK的相應位點構建分泌表達載體pPl5MK，插入片段置于該載體中mpd基因的上游，并使信號肽編碼序列與去除了自身信號肽編碼序列的mpd基因閱讀框恰好融合。將pPl5MK導入枯草桿菌構建表達菌株WB800(PP15MK)，在短短小芽孢桿菌啟動子和信號肽元件的帶動下，mpd基因能夠在表達菌株的對數(shù)生長期和穩(wěn)定期持續(xù)性高效分泌表達；發(fā)酵液在72 h酶活達到最高

9、值13.9 U／mL，是出發(fā)菌株鄰單胞菌M6表達量的14.5倍。 以毒素蛋白mazF基因為新型反向篩選標記構建了無標記同源重組載體pDGIEF，成功利用該載體實現(xiàn)了枯草桿菌淀粉酶基因amyE的刪除／插入失活和mpd基因在枯草桿菌amyE位點的插入整合表達。以枯草桿菌bpr基因的上游和下游序列為同源臂，構建了新的通用的可拆卸型載體plEFBPR。進一步構建了bpr基因的in-frame刪除載體pIEFBPR-ID，實現(xiàn)了bpr基因

10、的不改變其閱讀框的基因內部序列的刪除。本部分研究工作建立的通用型無標記同源重組體系采用了與以往的類似技術體系所不同的策略，打破了以往的無標記同源重組體系的局限，是進行枯草桿菌染色體分子生物學改造的方便而高效的工具。 通過將枯草桿菌模式菌株(供體菌)和野生的芽孢桿菌(受體菌)混合接觸培養(yǎng)而實現(xiàn)了不可自我轉移的pUBll0衍生載體向受體菌的轉移并實現(xiàn)了mpd基因在野生芽孢桿菌中的表達。實現(xiàn)野生芽孢桿菌的轉化一直是芽孢桿菌研究領域的一