PGRN與宮頸癌相關性及信號通路研究和RbAp48對宮頸癌細胞放射敏感性研究.pdf

1、第一部分、PGRN與宮頸癌的相關性及其信號轉(zhuǎn)導通路的研究
　　 宮頸癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌。2008年全球估計新發(fā)宮頸癌病例52.98萬，死亡病例25.51萬人，其中85％新發(fā)病例在發(fā)展中國家。在我國，每年新增的宮頸癌病人達15萬人左右，有大約2萬名婦女死于這種疾病。宮頸癌的發(fā)病率逐年上升，并呈年輕化趨勢。
　　 人乳頭瘤病毒（Humanpapillomaviruse，HPV）是引起宮頸癌病

2、變的首要因素。HPV是一類無包膜的DNA病毒，屬乳多空病毒科，根據(jù)其是否引起惡性病變，HPV分為兩種:低危型（如HPV6和HPV11等）和高危型（HPV16和HPV18等）。高危型的HPV與宮頸癌的發(fā)生有密切的關系，尤其是HPV16和HPV18。其中E6和E7是高危型HPV感染最重要的兩個癌基因，病毒基因組整合到人基因組增強了E6和E7的表達升高，E6和E7可分別抑制抑癌蛋白p53和Rb的表達，從而促進了細胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化。
　

3、　 顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種自分泌生長因子，最初在侵襲性小鼠畸胎瘤中被發(fā)現(xiàn)。PGRN是一類組織分布廣泛、功能多樣的生長因子，參與了早期胚胎發(fā)生、傷口修復、生長發(fā)育等多種重要的生理活動。研究表明，PGRN在多數(shù)腫瘤細胞中高度表達，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌和肝癌等腫瘤中具有致瘤功能，乳腺癌、卵巢癌和肝癌等中PGRN的高表達與腫瘤惡化相關，子宮內(nèi)膜癌和子宮平滑肌肉瘤的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)PGRN水平與腫瘤

4、的組織學分級呈正相關，表明PGRN具有用作腫瘤診斷標志物的潛力。
　　 PGRN可激活典型的生長因子信號途徑，包括Erk信號途徑中shc和p42/44MAPK與磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途徑中PI3K、蛋白激酶B/Akt和p70S6激酶的磷酸化。PGRN可啟動結(jié)合素(integrin)相關信號途徑中胞漿酪氨酸激酶——成簇黏附激酶(FAK)的磷酸化。在膀胱癌細胞中PGRN驅(qū)使FAK與樁蛋白和p44/p42MAPK的結(jié)合，暗示P

5、GRN和細胞外基質(zhì)信號可能存在相關性。近期，在膽管上皮癌中發(fā)現(xiàn)IL-6誘導的PGRN可以通過Akt依賴性的機制調(diào)控叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1(forkheadtranscriptionfactorsO1，F(xiàn)oxO1)的活性，從而促進細胞增殖。
　　 目前，PGRN在宮頸癌中的表達及功能還未見報道。本論文針對PGRN在宮頸癌中的表達，PGRN的表達對宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的影響，以及對相關信號途徑的調(diào)控做了初步的探討。
　　 一、PGR

6、N在宮頸癌中的表達
　　 本研究使用免疫組織化學法(Immunohistochemistry，IHC)檢測了正常宮頸、宮頸癌組織的石蠟切片中PGRN的表達。實驗結(jié)果顯示，宮頸癌組織中PGRN表達明顯高于正常宮頸組織。此外，使用westernblot檢測了宮頸癌細胞HeLa(HPV18+)、SiHa(HPV16+)和宮頸永生化細胞H8中PGRN的蛋白水平和培養(yǎng)基內(nèi)的分泌性PGRN的表達差異。Westernblot和Elisa檢測結(jié)

7、果發(fā)現(xiàn)，宮頸永生化細胞H8的胞內(nèi)和分泌性PGRN表達最低，而宮頸癌細胞HeLa表達最高。
　　 宮頸癌的形成與高危型HPVE6和E7蛋白密切相關，為了分析PGRN與癌蛋白E7之間是否存在相關性。本研究使用高表達HPV16-E7的人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE1)細胞系，通過westernblot檢測發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達HPV16-E7的RPE1細胞(RPE116E7)的PRGN的表達水平明顯高于RPE1對照細胞，提示HPV16-E7可能是誘導

8、宮頸上皮細胞中PGRN表達水平增高的關鍵誘導因素。
　　 本研究還調(diào)查了其他誘導因素對PGRN表達的影響，發(fā)現(xiàn)IL-6、雌激素均可促進PGRN在宮頸上皮細胞或?qū)m頸癌細胞中的表達。
　　 上述研究結(jié)果表明，在宮頸癌組織中、宮頸癌細胞內(nèi)或胞外，PGRN均存在高表達現(xiàn)象。在宮頸上皮細胞中，HPV16-E7、IL-6和雌激素是可能造成PGRN表達上調(diào)的誘導因素。由此推測PGRN有可能通過某些途徑參與了宮頸癌的惡性轉(zhuǎn)化。
　

9、　 二、PGRN對宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的影響
　　 為檢測PGRN是否影響宮頸上皮細胞的細胞行為，本研究使用重組人PGRN(recombinanthumanPGRN，rhPGRN)處理H8細胞，或使用干擾RNA與表達載體分別抑制HeLa細胞與增強H8細胞內(nèi)PGRN的表達水平，進而檢測其細胞增殖、克隆形成、細胞遷移等能力。結(jié)果顯示，外源性PGRN處理和PGRN內(nèi)源性高表達均促進了永生化細胞H8的增殖活性，克隆形成和遷移的能力。而干擾

10、PGRN表達后，宮頸癌細胞系HeLa的細胞增殖能力顯著下降。
　　 體內(nèi)動物實驗中發(fā)現(xiàn)，PGRN低表達可顯著抑制HeLa細胞在裸鼠中的腫瘤生長能力。此外，將HPV癌基因E6/E7和Ha-ras轉(zhuǎn)化的小鼠肺上皮細胞TC-1接種于PGRN基因敲除小鼠和野生型小鼠，結(jié)果顯示TC-1細胞在基因敲除小鼠成瘤能力較野生型小鼠顯著降低。相反，永生化宮頸上皮細胞H8接種的裸鼠，分別進行rhPGRN腹腔或瘤體注射可導致H8細胞成瘤。
　　

11、 本研究進一步檢測了PGRN對抑癌基因Rb和p53的表達影響，發(fā)現(xiàn)H8細胞經(jīng)rhPGRN刺激后，Rb和p53的表達均明顯降低。
　　 以上體外和體內(nèi)研究均表明，PGRN可以促進富頸癌永生化細胞的生長增殖和惡性轉(zhuǎn)化能力，而采用特異性siRNA干擾PGRN表達則導致富頸癌細胞HeLa的增殖能力的降低。PGRN促進宮頸上皮細胞增殖等細胞行為可能與PGRN降低p53、pRb表達有關。
　　 三、PGRN對PI3K/Akt/mTO

12、R信號途徑的影響
　　 PI3K/Akt/mTOR信號途徑在癌癥中的作用一直以來都是腫瘤相關研究的熱點之一。PI3K/Akt與Erk信號均參與調(diào)控雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號途徑，Akt、p70S6K以及FoxO1也均為mTOR信號途徑的成員，提示PGRN激活的PI3K/Akt和Erk途徑可能涉及mTOR信號途徑。
　　 本研究首次較為全面的檢測了PGRN對PI3K/Akt/mTOR信號途徑的影響，結(jié)果顯示PGRN激活

13、了宮頸上皮永生化細胞H8中Akt和mTOR的磷酸化并調(diào)控了mTORC1下游信號途徑分子p70S6K、4E-BP1、FoxO1等的活性。PI3K/Akt抑制劑LY2940002的加入阻止了PGRN誘導的mTOR的激活，說明了PGRN誘導的mTOR磷酸化依賴于PI3K的活性。同時PGRN也可促進mTORC2的活性，重組PGRN處理H8細胞可誘導mTORC2下游分子Akt473位絲氨酸磷酸化，促進Akt控制的凋亡基因相關轉(zhuǎn)錄因子FoxO1的磷

14、酸化和出核失活。
　　 以上結(jié)果顯示PGRN激活了Akt/mTOR信號途徑，而Akt/mTOR信號途徑影響到許多重要的細胞功能，在調(diào)控基本的細胞行為如細胞生長、增殖與存活中具有關鍵作用。本研究進一步證實了PGRN誘導的細胞增殖和抗凋亡等功能與PGRN激活的PI3K/Akt/mTOR信號途徑具有重要的相關性，從而能部分解釋了PGRN調(diào)控宮頸癌細胞增殖的原因。
　　 綜上所述，本研究首次提出PGRN與宮頸癌的密切相關性。初步

15、探討了PGRN在宮頸癌細胞中表達的誘導因素以及PGRN促進宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的功能及其信號轉(zhuǎn)導機制。本研究揭示了微環(huán)境因素對宮頸癌發(fā)病機制的影響，為包括宮頸癌在內(nèi)的PGRN相關腫瘤提供了新的治療靶位，有助于抗癌藥物的優(yōu)化和創(chuàng)新。
　　 第二部分RbAp48調(diào)控富頸癌細胞放射敏感性的研究
　　 宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居婦女惡性腫瘤第2位。尤其是近年來出現(xiàn)全球發(fā)病年輕化趨勢，嚴重威脅著廣大婦女的健康。據(jù)WH

16、O統(tǒng)計，全球每年新發(fā)宮頸癌病例50萬，約80％的病例發(fā)生在發(fā)展中國家，中國約有15萬人，其中每年全球的死亡病例約20萬。
　　 大量研究資料表明人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）是宮頸癌發(fā)生的首要啟動因子。HPV是一種無包膜的小DNA病毒，其中HPV16、18亞型對宮頸移行帶具高度親和力，與宮頸癌關系最為密切。HPV的轉(zhuǎn)化基因主要包括病毒的早期基因E6和E7，該基因編碼的蛋白產(chǎn)物與細胞生命周期的活性蛋

17、白相互作用，使細胞分化、增殖和凋亡紊亂，誘發(fā)腫瘤的形成。
　　 RbAp48，作為一種廣泛存在的Rb蛋白結(jié)合蛋白，能夠協(xié)同其他蛋白調(diào)節(jié)組蛋白及其核小體相關組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HDAC)復合物的構(gòu)型和活性，從而抑制E2F調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。我們課題組之前的研究首先報道了RbAp48是一種具有調(diào)控HPV陽性宮頸癌轉(zhuǎn)化活性的重要蛋白，RbAp48在宮頸癌中低表達，在HPV陽性宮頸癌細胞系中過表達RbAp48能夠抑制細胞的生長增殖及腫瘤形

18、成，其機制與RbAp48調(diào)節(jié)HPV癌基因E6、E7、c-myc，抑癌基因Rb、p53以及Rb/E2F靶位基因的表達有關，提示RbAp48有可能作為一種HPV相關腫瘤的治療靶位。
　　 新近研究發(fā)現(xiàn)，RbAp48也是一種放射敏感性蛋白。在對腫瘤細胞放射敏感性相關基因的篩選中，RbAp48作為被鑒定出來的三個重要基因中的其中之一，其在放射敏感細胞系中的表達明顯高于放射耐受細胞系。將RbAp48轉(zhuǎn)入乳腺癌細胞系HS-578T、MDA-

19、MB-231以及黑色素瘤細胞系MALME-3M后，能夠明顯增加細胞周期中放射敏感階段G2/M的細胞比例，從而提高腫瘤細胞的放射敏感性。目前宮頸癌的治療方法主要是手術和放療，尤其晚期以放療為主。與前列腺腫瘤、頭頸部軟組織腫瘤以及其它腫瘤類似，宮頸癌的治愈率在很大程度上取決于腫瘤細胞對放射治療的敏感性。迄今，RbAp48與宮頸癌放射敏感性的關系尚未見報道。本研究在以往研究的基礎上將重點探討RbAp48與宮頸癌細胞放射敏感性的關系及其作用機制

20、。
　　 一、RbAp48在放射后富頸癌細胞中的表達
　　 本研究將確定在宮頸癌中RbAp48是否是一種放射敏感性蛋白，即RbAp48的表達在射線照射前后是否有差別，以及這種差別是否決定細胞的放射敏感性。采用免疫印跡和實時定量PCR檢測HPV陽性宮頸癌細胞SiHa、Caski和HeLa細胞在x-射線照射前后的RbAp48表達水平差異，結(jié)果顯示照射后的RbAp48在mRNA水平和蛋白水平均顯著升高，從而確定RbAp48在宮

21、頸癌細胞中是放射敏感蛋白。
　　 二、RbAp48對宮頸癌細胞放射敏感性的影響
　　 本研究分別自抑制RbAp48和過表達RbAp48的角度，觀察干預RbAp48對宮頸癌細胞生長增殖及細胞放射敏感性的影響。用pcDNA3.1-RbAp48轉(zhuǎn)染SiHa、Caski和HeLa細胞后構(gòu)建穩(wěn)定過表達RbAp48的細胞系，用RbAp48特異的小干擾RNA和陰性對照siRNA分別轉(zhuǎn)染細胞抑制細胞內(nèi)RbAp48的表達。細胞接受不同劑量

22、x-射線處理后，通過CCK-8試劑、細胞計數(shù)、平板克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗觀察RbAp48對宮頸癌細胞放射敏感性的影響。
　　 實驗結(jié)果顯示，RbAp48過表達能顯著抑制照射處理后細胞的增殖，克隆形成和惡性程度。而抑制RbAp48的表達，則能降低射線對細胞增殖生長的抑制作用。進一步說明RbAp48確實能提高宮頸癌細胞的放射敏感性。
　　 三、RbAp48提高富頸癌細胞放射敏感性的機制研究
　　 有研究報道

23、RbAp48能夠明顯增加乳腺癌細胞和黑色素瘤細胞細胞周期中放射敏感階段G2/M的細胞比例，從而提高腫瘤細胞的放射敏感性。本研究將從細胞周期、細胞凋亡和腫瘤相關基因分析對RbAp48促進宮頸癌細胞放射敏感性的機制作初步探討。采用流式細胞術分別檢測過表達RbAp48、干擾RbAp48的宮頸癌細胞和對照細胞經(jīng)x-射線照射前后細胞周期和細胞凋亡的變化。實時定量PCR檢測照射前后各細胞中腫瘤相關基因p53，Rb和Caspase-8的表達變化。

24、r>　　 實驗結(jié)果顯示，改變宮頸癌細胞內(nèi)RbAp48的表達或單獨射線處理均能一定程度的影響細胞周期和凋亡。過表達RbAp48能明顯引起射線處理宮頸癌細胞的G2/M阻滯和細胞凋亡;而射線引起的宮頸癌細胞G2/M期細胞比例和凋亡細胞數(shù)的升高，在細胞內(nèi)RbAp48表達被抑制后明顯下降。實時定量PCR結(jié)果同樣顯示了過表達RbAp48或抑制RbAp48和射線處理均能夠改變SiHa、Caski和HeLa細胞中的p53、Rb和Caspase-8的表

25、達水平。但過表達RbAp48聯(lián)合射線治療更為顯著的增強了p53、Rb和Caspase-8的表達水平，而干擾宮頸癌細胞RbAp48后，射線引起的p53、Rb和Caspase-8的表達升高明顯受到抑制。
　　 以上結(jié)果表明，宮頸癌細胞內(nèi)RbAp48的表達變化能顯著影響細胞照射后的細胞周期、細胞凋亡以及腫瘤相關基因的表達水平，說明RbAp48促進宮頸癌放射敏感性的作用是通過阻滯細胞周期G2/M期、增加細胞凋亡、促進抑癌基因p53和Rb

26、以及凋亡相關基因Caspase-8的表達來實現(xiàn)的。
　　 四、腺病毒介導的RbAp48高表達對富頸癌細胞放射敏感性的影響
　　 為進一步確定RbAp48在宮頸癌放射敏感性中的生物學功能，我們構(gòu)建了RbAp48重組腺病毒（Ad5-RbAp48），并進行了動物體內(nèi)實驗。Westernblot結(jié)果顯示，Ad5-RbAp48能有效提高細胞中RbAp48的表達水平。裸鼠接種宮頸癌細胞SiHa和HeLa成瘤后，分別接受Ad5-RbA

27、p48治療、射線治療和Ad5-RbAp48協(xié)同射線聯(lián)合治療，觀察裸鼠體內(nèi)成瘤的差異。實驗結(jié)果顯示，Ad5-RbAp48協(xié)同射線治療能有效的抑制富頸癌細胞成瘤，提高治療效果。說明腺病毒介導的RbAp48高表達明顯提高了宮頸癌細胞的放射敏感性。
　　 綜上所述，本研究首次提出了RbAp48與宮頸癌放射敏感性之間的密切關系，并初步探討了RbAp48提高宮頸癌細胞放射敏感性的相關機制。結(jié)果顯示，x-射線能引起宮頸癌細胞系SiHa、Cas