采用基因敲除手段降低啤酒酵母蛋白酶A表達(dá)的研究.pdf

1、啤酒泡沫的穩(wěn)定性，是當(dāng)今世界啤酒質(zhì)量難以保證的問(wèn)題之一，如何提高啤酒泡沫穩(wěn)定性已成為啤酒工業(yè)界及相關(guān)科研人員的研究熱點(diǎn)。 研究發(fā)現(xiàn)有幾種蛋白質(zhì)與啤酒泡沫之間有很大的相關(guān)性，與此同時(shí)大量研究結(jié)果表明：來(lái)自酵母細(xì)胞的蛋白酶A可能消化有助于啤酒泡沫穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)，同時(shí)產(chǎn)生沒(méi)有起泡性能的多肽或者導(dǎo)致泡沫蛋白質(zhì)分子分解，因此導(dǎo)致最終成品啤酒中泡沫穩(wěn)定性變?nèi)酢?酵母蛋白酶A是由位于酵母染色體XⅥ上的YPL154C/PEP4基因編碼，

2、堿基從259713b到260930b，共1218個(gè)堿基對(duì)。本論文根據(jù)PEP4基因與特定質(zhì)粒(pFA6a-kanMX4)DNA的堿基序列設(shè)計(jì)了兩條引物，將之用于PCR擴(kuò)增，得到一段兩端為PEP4基因同源序列，中間為G418抗性基因序列的外源DNA片段，將這段帶有選擇性標(biāo)識(shí)的外源基因連接到載體(pGM-TEasy)上，重新構(gòu)建質(zhì)粒，將其通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入啤酒酵母細(xì)胞，經(jīng)其在酵母體內(nèi)與PEP4基因發(fā)生同源重組，將PEP4基因敲除，再經(jīng)過(guò)抗性

3、篩選，得到一株P(guān)EP4基因缺陷型工業(yè)菌株。經(jīng)過(guò)抗性驗(yàn)證、PCR產(chǎn)物驗(yàn)證、PCR產(chǎn)物單酶切驗(yàn)證及羧肽酶Y平板驗(yàn)證后，證實(shí)外源基因已成功轉(zhuǎn)入酵母體內(nèi)。 將轉(zhuǎn)基因酵母進(jìn)行傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)與發(fā)酵穩(wěn)定性試驗(yàn)，并測(cè)量發(fā)酵液各項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因酵母?jìng)鞔€(wěn)定性良好。觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因酵母發(fā)酵液的起泡性良好，泡持性大約為3.5min，而原酵母菌株發(fā)酵液泡持性大約為2min。轉(zhuǎn)基因酵母經(jīng)馴化后進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，再利用國(guó)際上先進(jìn)的蛋白酶A檢測(cè)方法—熒光底物法分