深海油脂酵母篩選及利用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)微生物柴油的初步研究.pdf

1、本論文磨合當前所關注的有關深海微生物、生物能源、廢物綜合利用3個熱點問題,采用熒光觀測和氣相色譜質譜聯(lián)用等技術,篩選深海油脂酵母,利用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂并初步探討將其轉化為柴油的工藝。本研究主要由國家海洋局基本科研業(yè)務費專項資金項目(2010009)資助,于海洋三所國家海洋局海洋生物遺傳重點實驗室完成。主要結果如下:
　　 采用培養(yǎng)基添加尼羅紅后檢測菌落熒光情況(在紫外燈下)的方法對大洋DY115-19、DY115-20航次

2、分離獲得的385株酵母進行產(chǎn)油菌株的初篩,總共獲得22株產(chǎn)油酵母,其中20株來自西太平洋暖池區(qū),2株來自東太平洋多金屬結合區(qū)。所得產(chǎn)油酵母經(jīng)葡萄糖搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后,采用有機溶劑法進行復篩,結果顯示除6株酵母外(油脂含量接近20％),其余16株均為高產(chǎn)油脂酵母(油脂含量29.3％-62.9％)。
　　 通過26SrDNA D1/D2區(qū)的序列分析方法對22株高產(chǎn)酵母菌株進行分子鑒定,并結合早期鑒定結果,對總共110株產(chǎn)油及非產(chǎn)油酵母進

3、行了統(tǒng)計。結果顯示不同種類酵母在深海中分布數(shù)量存在較大差異,在所有檢測到的15種酵母中,相對數(shù)目分布較多的為Candida parapsilosis,Debaryomyces hansenii、Rhodosporidium paludigenum、Candida tropicalis。而篩選到得產(chǎn)油酵母僅分布于6個種,其中出現(xiàn)比例最高的為Candida viswanathii,其次為Rhodosporidiumpaludigenum,表

4、明深海產(chǎn)油酵母種類與目前常見的產(chǎn)油酵母一致,但種類分布更加狹窄。
　　 考慮到油脂生產(chǎn)成本,尋找可利用廉價底物高產(chǎn)油脂的微生物具有深遠的意義。本文分別選擇葡萄糖及廉價的糖蜜作為碳源,比較16株產(chǎn)油酵母在兩種培養(yǎng)基中產(chǎn)油性能差異,結果顯示所有酵母在葡萄糖培養(yǎng)基中具有穩(wěn)定的產(chǎn)油能力。而在糖蜜培養(yǎng)基中,雖然多數(shù)酵母菌株生長旺盛,但油脂含量卻大幅度下降,除近平滑假絲酵母2A00015產(chǎn)油能力未發(fā)生太大變化外(油脂含量40.81％,油脂系

5、數(shù)10.93),其他酵母菌株油脂含量均低于30％。表明糖蜜中存在某種影響因素阻礙了大多數(shù)酵母油脂合成,而酵母2A00015可能存在特殊的油脂代謝途徑或產(chǎn)生特殊物質可抵抗不良因素的影響,因此我們選擇該酵母作為后續(xù)擴大培養(yǎng)的試驗菌株。
　　 由于傳統(tǒng)有機溶劑法提取酵母油脂需要消耗大量時間及有機溶劑,而且還容易產(chǎn)生環(huán)境污染。因此,在優(yōu)化糖蜜培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件之前,建立了一套以產(chǎn)油酵母2A00015為試驗菌株,利用尼羅紅特性快速測定油脂含

6、量的簡便方法,該測定方法得到相對熒光強度與稱重法得到油脂含量呈正相關性(R2=0.9608)。以上述方法作為油脂檢測手段,并結合正交設計和單因子試驗對2A00015酵母菌株的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化,最后確定培養(yǎng)基最佳氮源為硫酸銨,最優(yōu)培養(yǎng)基成份為糖蜜(總糖濃度)110 g/L,硫酸銨1.0 g/L,酵母粉0.8 g/L,磷酸二氫鉀0.5g/L,碳氮比為137:1,相對油脂合成而言,糖蜜的濃度影響最大,其次分別為硫酸銨和磷酸二氫鉀,酵母

7、粉的影響最小。最佳發(fā)酵條件包括,搖瓶裝液量50mL/250mL,接種量為10％,初始pH5.0,培養(yǎng)基鹽度30％,培養(yǎng)溫度27℃。另外,我們還考察Mg2+、Fe2+,Mn2+、Zn2+、Cu2+5種金屬離子對酵母油脂合成的影響,結果顯示除Cu2+外,其他4種金屬離子在一定濃度下均可提高油脂含量。經(jīng)過上述優(yōu)化后得到菌體生物量和油脂產(chǎn)量分別為15.28 g/L、8.74 g/L,與未優(yōu)化前比較,生物量提高35.94％,油脂產(chǎn)量提高90.4％

8、。
　　 本文還對酵母油脂提取工藝及生物柴油制備方法進行初步探索,確定了凍融-酸熱法(少量樣品)和高壓均質機法(大量樣品)為最佳細胞破碎方法,乙醚-石油醚(2:1)混合液為最佳有機溶劑提取液。并在離子液體催化酯交換反應制備生物柴油過程中,對醇油比、反應溫度、反應時間、催化劑使用量進行了優(yōu)化。所得生物柴油經(jīng)氣相色譜-質譜(GC/MS)測定,其主要成分為:亞油酸甲酯40.98％,油酸甲酯32.18％,硬脂肪酸甲酯16.07％,棕櫚酸