微生物利用甘蔗糖蜜發(fā)酵產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究.pdf

1、多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是指含兩個或兩個以上雙鍵且碳原子數(shù)為16-22的直鏈脂肪酸，主要有亞油酸(Linoleic acid，LA)、γ-亞麻酸(γ-Linolenic acid，GLA)、花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)、α-亞麻油(α-Linolenic acid，ALA)、廿碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)和廿二碳六烯酸

2、(Docosahexaeraoic acid，DHA)等。多不飽和脂肪酸大多數(shù)是生物活性物質(zhì)的前體，尤其是對智力發(fā)育、心血管病等有良好效果。此外PUFAs還可用作食品添加劑、營養(yǎng)配方、健康輔料以及保健品等。微生物所具有的營養(yǎng)簡單、生長繁殖快、易變異、可工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)決定了利用微生物生產(chǎn)油脂是一條開發(fā)新油源的良好途徑。目前國內(nèi)外研究通常利用葡萄糖、淀粉和蔗糖等作為碳源生產(chǎn)多不飽和脂肪酸。作者試圖從土壤中篩選出以甘蔗糖蜜為碳源，發(fā)酵

3、生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的菌株，并對菌株進(jìn)行誘變育種，發(fā)酵條件，代謝調(diào)控，油脂的分離提取和富集等方面進(jìn)行研究，以及利用氣相色譜進(jìn)行油脂組成和含量鑒定分析。本研究的結(jié)果如下： 1、利用蘇丹黑B染色和測定多不飽和脂肪酸碘值的方法，從土壤中篩選出一株適合用甘蔗糖蜜為原料生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的霉菌LB1。對LB1菌株進(jìn)行形態(tài)特征、生理特征分析及5.8S rDNA基因兩側(cè)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隙進(jìn)行序列分析推斷該菌株為反屈毛霉屬(Mucor recurvus

4、)。 2、以土壤篩選到的反屈毛霉LB1為出發(fā)菌株，通過60Co輻射復(fù)合LiC1誘變，進(jìn)行富含多不飽和脂肪酸菌株的選育。菌種的篩選主要以含脂量以及碘值的高低作為選擇菌株的依據(jù)，篩選到一株不飽和脂肪酸高產(chǎn)菌株MR-10，較原始菌株總脂含量增加35.42％，碘值增加36.56％，PUFAs增加43.76％。將篩選出的菌株分別進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測試表明，菌株經(jīng)過五次轉(zhuǎn)代培養(yǎng)，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。 3、在反屈毛霉LB1發(fā)酵條件優(yōu)化的

5、實驗中，探討了不同碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉以及PDA等對發(fā)酵的影響。從結(jié)果和糖蜜的成分分析以及經(jīng)濟(jì)角度考慮，糖蜜可以作為發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的碳源，且糖蜜的最佳濃度為15％。同時確定尿素為最佳氮源，最佳C/N比為35/1。通過單因子試驗和正交實驗，得到發(fā)酵生產(chǎn)不飽和脂肪酸的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速160 rpm，培養(yǎng)時間5天。在上述條件下，反屈毛霉LB1發(fā)酵可得生物量、總脂量和PUFAs產(chǎn)量分別達(dá)到12.51 g/L，

6、7.13 g/L和5.74 g/L。 4、在反屈毛霉LB1發(fā)酵代謝調(diào)控中，在發(fā)酵過程中補(bǔ)加十八醇、十六醇和正丁醇前體物，得出補(bǔ)加十六醇可以提高菌絲的油脂和不飽和脂肪酸含量。在發(fā)酵24小時后補(bǔ)加1.5％的十六醇，可獲得最大的油脂含量8.24 g/L；碘值113.84，PUFAs 6.96 g/L。 培養(yǎng)基中添加適量濃度金屬離子Mg2+可以提高菌絲多不飽和脂肪酸的產(chǎn)量，當(dāng)MgSO4在20-30 mmol/L范圍內(nèi)，生物量、油

7、脂含量、碘值及PUFAs隨MgSO4的增加而增加。當(dāng)Mg2+濃度為30 mmol/L時，油脂含量6.62 g/L；碘值109.10，PUFAs 5.16 g/L。高于30 mmol/L時，生物量、油脂含量、碘值及PUFAs有所下降，說明高濃度的金屬離子對發(fā)酵生產(chǎn)有抑制作用。 在培養(yǎng)中添加適量的維生素可以提高油脂中PUFAs的含量，但對生物量影響不大。維生素B1和維生素B6作為油脂生物合成過程中合成酶的輔助因子，在不飽和脂肪酸的形

8、成起到重要作用。維生素的添加量也有一定的影響，隨添加維生素濃度的增加，油脂的碘值和PUFAs有所增加，維生素B1添加量為0.20 mg/mL較為合適，而維生素B6 0.25 mg/mL為適宜，說明高濃度維生素對不飽和脂肪酸的積累有利。 代謝調(diào)控中低溫老化是增加不飽和脂肪酸產(chǎn)量的一種有效方法，反屈毛霉LB1在5℃儲存15天后，油脂含量由5天的5.18 g/L到5.72 g/L，PUFAs由3.37 g/L到4.60 g/L。利用低

9、溫和老化的共同作用可以提高不飽和脂肪酸的含量。 5、在石油醚萃取，正己烷萃取和鹽酸水解乙醚抽提等三種油脂分離提取方法中，采用鹽酸水解乙醚抽提方法為本研究油脂提取方法，多不飽和脂肪酸富集部分采用尿素包合．冷凍結(jié)晶法進(jìn)行。研究表明當(dāng)混合酸：乙醇：尿素=1:1.5:7.5時，富集效果最佳。在此條件下富集，微生物油脂中的碘值從原來的91.20提高到102.45，油脂的不飽和度提高了12.35％。 6、采用菌體直接進(jìn)行油脂的甲酯化

10、方法，通過氣相色譜分析油脂和不飽和脂肪酸的組成和含量。通過樣品和標(biāo)品氣相色譜出峰及保留時間的對照，利用面積歸一化計算，得出菌株的油脂含量為7.13 g/L，不飽和脂肪酸含量達(dá)到5.74 g/L。其中油脂中多不飽和脂肪酸的組成及含量為：油酸885mg/L，亞油酸825 mg/L、γ-亞麻酸1352 mg/L、α-亞麻酸176 mg/L、花生四烯酸567 mg/L、廿碳五烯酸467 mg/L、廿二碳六烯酸348 mg/L。 7、價格