微生物發(fā)酵法生產(chǎn)尼平的研究.pdf

1、京尼平是一種環(huán)烯醚萜類無毒物質(zhì),易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑,是梔子中起主要藥效作用的重要成分,對(duì)抗炎、治療肝臟疾病、抗脂質(zhì)過氧化、降壓、緩解Ⅱ型糖尿病癥狀、抗NO生成、通便等具有良好效果。它同時(shí)是一種優(yōu)良的天然生物交聯(lián)劑,具有生物相容性好、細(xì)胞毒性小、抗降解能力強(qiáng)和應(yīng)用領(lǐng)域廣泛等優(yōu)點(diǎn)。京尼平在自然界中的含量很少。據(jù)報(bào)道,梔子中京尼平的含量?jī)H為0.005％～0.01％左右,因此直接提取十分困難。目前的制備方法一般采用酶解法

2、,即利用β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷生產(chǎn)京尼平,但由于其成本較高,從而限制了它的應(yīng)用,未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。而微生物發(fā)酵法通過常溫、常壓條件下微生物的發(fā)酵直接實(shí)現(xiàn)京尼平苷的轉(zhuǎn)化,不僅能夠避免酶法生產(chǎn)需要提純京尼平苷及酶的缺陷,同時(shí)最大限度的保護(hù)有效成分免遭破壞,有利于簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本,提高產(chǎn)率。本文研究了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)京尼平的整個(gè)工藝流程,包括菌種的選育、發(fā)酵及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化和產(chǎn)物的分離純化,為京尼平的工業(yè)化生產(chǎn)提供一條切實(shí)可行

3、的途徑。
　　 本論文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.從土壤中經(jīng)過初篩、復(fù)篩得到一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株FYS-9,經(jīng)形態(tài)觀察及18S Rdna序列比對(duì)分析,鑒定為泡盛曲霉(Aspergillusawamori)。
　　 2.以:FYS-9為出發(fā)菌株,通過紫外及原生質(zhì)體誘變,篩選得到一株酶活力較FYS-9提高近39.4％的突變株70C-3。對(duì)70C-3產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,并研究了其β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性

4、質(zhì),確定了其產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:麩皮+玉米芯(1:1)3％,(NH4)2SO40.5％,KH2PO40.2％,吐溫800.1％,MgSO4·7H2O0.05％,微量離子液1.5 Ml/L。通過該培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活達(dá)到45.16 IU/Ml。且其所產(chǎn)酶的最適溫度為60℃,最適Ph為5.0。
　　 3.發(fā)酵生產(chǎn)京尼平條件的優(yōu)化。確定最佳轉(zhuǎn)化條件為:以京尼平苷為反應(yīng)底物時(shí),30℃,150 r/min,添加京尼平苷1.5％

5、轉(zhuǎn)化24 h,京尼平苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)到97.7％,京尼平的含量達(dá)8.5 g/L;經(jīng)測(cè)定梔子粉中京尼平苷的含量為6.738％。以梔子粉直接發(fā)酵時(shí),6％梔子粉,于30℃,170 r/min條件下接種發(fā)酵培養(yǎng)96 h,京尼平苷的最大轉(zhuǎn)化率達(dá)116.36％。
　　 4.選取H-103大孔樹脂吸附京尼平,上柱液流速為2 Ml/min,以60％乙醇水溶液作為洗脫劑,經(jīng)重結(jié)晶純化后獲得純度達(dá)98.2％的京尼平,整個(gè)工藝收率為77.8％。后經(jīng)HPL