載BMP2活性肽的羧基化氧化石墨烯-煅燒骨三維多孔材料的制備及成骨活性研究.pdf

1、第一部分羧基化氧化石墨烯/煅燒骨的制備及理化性質(zhì)的研究
　　目的探討羧基化氧化石墨烯/煅燒骨的制備方法，并評(píng)價(jià)其理化性質(zhì)。
　　方法通過改良Hummers法制備氧化石墨烯(GO)，并將氧化石墨烯羧基化以制備羧基化氧化石墨烯(CGO)，采用傅里葉紅外光譜儀(FTIR)和X射線光電子能譜(XPS)對(duì)制備的CGO進(jìn)行鑒定。制備0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的CGO懸浮液，將邊長(zhǎng)為5mm的煅燒骨(TBC)立方體浸入懸浮

2、液中，通過超聲復(fù)合2h和6h，分別制備0.5mg/ml-2h、1mg/ml-2h、2mg/ml-2h、1mg/ml-6h、2mg/ml-6h五種不同的羧基化氧化石墨烯/煅燒骨(CGO-TBC)。每個(gè)樣品采用三維視頻顯微鏡和場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)評(píng)價(jià)CGO在TBC材料表面的分布情況及CGO-TBC的表面形貌，選取最佳復(fù)合濃度和時(shí)間的CGO-TBC，并與TBC材料作比較測(cè)定其孔徑、孔隙率、抗折壓強(qiáng)度。
　　結(jié)果通過FTIR和X

3、PS檢測(cè)，表明氧化石墨烯已成功羧基活化。三維視頻顯微鏡和SEM對(duì)比五種不同CGO-TBC，選取1mg/ml-6h的CGO-TBC具有最佳CGO分布及表面納米形貌。CGO-TBC的孔隙率和孔隙大小與TBC無明顯差別，CGO-TBC的抗壓和抗折強(qiáng)度較TBC更高。
　　結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功制備CGO，并且TBC在1mg/ml的CGO懸浮液中超聲復(fù)合6h可獲得最佳CGO分布和材料表面形貌的CGO-TBC，CGO-TBC具有良好的表面形貌和孔隙結(jié)

4、構(gòu)，具有更好的生物力學(xué)強(qiáng)度。
　　第二部分羧基化氧化石墨烯/煅燒骨的生物相容性以及載BMP2活性多肽pBMP2后體外控釋的研究
　　目的評(píng)價(jià)CGO-TBC的生物相容性，并負(fù)載BMP2活性多肽pBMP2以評(píng)價(jià)其在體外的藥物釋放動(dòng)力學(xué)。
　　方法制備 CGO-TBC材料浸提液，采用浸提液進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)、微核實(shí)驗(yàn)、局部皮膚刺激實(shí)驗(yàn)、熱原檢查實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)，并將材料植入肌袋進(jìn)行肌袋植入實(shí)驗(yàn)，在 CGO-TBC表面接種 MC3

5、T3-E1細(xì)胞，通過鈣黃綠素/碘化丙啶染色，熒光顯微鏡下觀察并評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞相容性。將 TBC和CGO-TBC分別負(fù)載 BMP2活性多肽pBMP2，評(píng)價(jià)pBMP2在兩種支架材料中的藥物釋放動(dòng)力學(xué)。
　　結(jié)果急性毒性實(shí)驗(yàn)未見大鼠大體觀及臟器有明顯異常，微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)陰性，局部皮膚刺激未見明顯水腫紅斑，熱原檢查實(shí)驗(yàn)符合標(biāo)準(zhǔn)，溶血實(shí)驗(yàn)陰性，肌袋植入實(shí)驗(yàn)可見材料周圍形成完整的纖維包膜，熒光顯微鏡下觀察MC3T3-E1細(xì)胞存活良好，形態(tài)和分布

6、正常。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明pBMP2在CGO-TBC內(nèi)釋放更加緩慢。
　　結(jié)論 CGO-TBC生物相容性良好，體外釋放pBMP2較TBC材料更為緩慢，適宜作為一種骨修復(fù)支架材料和緩釋藥物載體。
　　第三部分羧基化氧化石墨烯/煅燒骨對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的形態(tài)、粘附以及負(fù)載pBMP2后對(duì)細(xì)胞增殖、分化的影響
　　目的評(píng)價(jià)CGO-TBC與TBC對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞粘附率、形態(tài)分布的影響，并負(fù)載pBMP2和rhBMP2后評(píng)價(jià)其

7、對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和成骨分化的影響
　　方法將小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1種植在TBC和CGO-TBC表面，鈣黃綠素/碘化丙啶染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、分布等情況，多聚甲醛固定后在場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察其在材料表面的形態(tài)和分布情況。通過間接計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞在CGO-TBC和TBC表面的粘附率情況。將3mg的pBMP2或1μ g的rhBMP2負(fù)載在TBC和CGO-TBC表面，實(shí)驗(yàn)分為TBC組、CGO-TBC組

8、、pBMP2/TBC組、pBMP2/CGO-TBC組、rhBMP2/TBC組、rhBMP2/CGO-TBC組，將MC3T3-E1細(xì)胞種植在材料上，采用MTT法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞在不同材料上的增殖活性，通過檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)活性來評(píng)價(jià)MC3T3-E1細(xì)胞在不同材料上的成骨分化活性
　　結(jié)果鈣黃綠素/碘化丙啶染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見 TBC和CGO-TBC上的MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)正常，CGO-TBC上的細(xì)胞

9、鋪滿支架小梁，排列較為有序。掃描電鏡下觀察可見細(xì)胞在小梁凹陷處分布較多，CGO-TBC上的細(xì)胞較TBC的細(xì)胞立體結(jié)構(gòu)更為飽滿。粘附率測(cè)定顯示，CGO-TBC對(duì)細(xì)胞粘附率顯著高于TBC組。MTT增殖和ALP活性測(cè)定顯示，pBMP2能有效促進(jìn)MC3T3-E1的增殖和成骨分化，CGO-TBC較TBC對(duì)細(xì)胞的增殖和分化具有一定的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論 CGO-TBC材料較TBC材料對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、粘附具有一定的有利影響，在負(fù)載 pBMP2后能

10、作為一種骨誘導(dǎo)材料影響 MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和成骨分化，pBMP2可發(fā)揮類似BMP2的骨誘導(dǎo)作用。
　　第四部分羧基化氧化石墨烯/煅燒骨負(fù)載pBMP2修復(fù)大鼠顱骨缺損模型的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的進(jìn)一步評(píng)價(jià)pBMP2和CGO-TBC在大鼠顱骨臨界骨缺損模型中修復(fù)骨缺損的能力和效果，探討其在體內(nèi)環(huán)境中對(duì)骨缺損修復(fù)的可行性和療效。
　　方法將TBC和CGO-TBC負(fù)載3mg的pBMP2或1μ g的rhBMP2，植入大鼠顱骨

11、臨界骨缺損模型中觀察成骨情況。實(shí)驗(yàn)分為6組：TBC組、CGO-TBC組、pBMP2/TBC組、pBMP2/CGO-TBC組、rhBMP2/TBC組、rhBMP2/CGO-TBC組。將24只大鼠隨機(jī)分為6組，制備直徑5mm的大鼠顱骨臨界骨缺損模型并植入上述材料，12W后行大體觀、X線檢查、CT三維重建和組織學(xué)切片HE染色評(píng)價(jià)骨缺損修復(fù)情況。
　　結(jié)果12W后，TBC組和CGO-TBC組材料與宿主骨之間界限明顯，材料大小無明顯改變，C

12、T三維重建顯示缺損處凹陷明顯，HE染色提示TBC組無明顯新骨形成，CGO-TBC組在宿主骨邊緣有少量新骨形成；pBMP2/TBC組和pBMP2/CGO-TBC組在X線下見材料周圍低密度影界限較少，三維重建顯示pBMP2/TBC組缺損凹陷明顯，pBMP2/CGO-TBC組存在線狀或點(diǎn)狀凹陷，HE染色顯示pBMP2/TBC組在宿主骨邊緣附著少量新生骨，骨纖維排列混亂，pBMP2/CGO-TBC組可見宿主骨周圍大量新骨形成，材料中央有新骨和類

13、骨質(zhì)形成；rhBMP2/TBC組和rhBMP2/CGO-TBC組材料與宿主骨之間界限模糊，材料大小減少明顯，CT三維重建顯示rhBMP2/TBC組存在線狀或點(diǎn)狀凹陷，rhBMP2/CGO-TBC組缺損處未見凹陷，HE染色顯示rhBMP2/TBC組內(nèi)可見宿主骨邊緣和材料中央有新骨形成，骨纖維排列較為混亂；F組rhBMP2/CGO-TBC可見宿主骨邊緣和材料中央有大量新骨形成，并出現(xiàn)板層化。成骨面積百分比顯示，TBC組和CGO-TBC組成骨