孔徑在調(diào)節(jié)多孔rhBMP-2-CPC活性人工骨的成骨活性和降解性的作用研究.pdf

1、對(duì)于骨缺損的修復(fù)，目前臨床多采用自體骨移植和同種異體骨移植的方法，但是自體骨移植存在來源有限，二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)，異體骨移植會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。為了解決這些問題，骨組織工程研究受到了普遍關(guān)注，并成為具有一定應(yīng)用前景的治療骨缺損的手段。骨組織工程研究要素包括種子細(xì)胞、骨誘導(dǎo)因子、支架材料選擇以及三者的復(fù)合物，其中骨支架材料的設(shè)計(jì)和選擇是該研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。理想的骨支架材料應(yīng)該具有良好的生物相容性、可降解性、骨傳導(dǎo)性和足夠的力學(xué)強(qiáng)度。此外，理

2、想的骨支架材料還能夠作為載體復(fù)合具有成骨誘導(dǎo)活性的生長(zhǎng)因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bonemorphogeneticprotein，BMP），使材料具有骨誘導(dǎo)活性。磷酸鈣骨水泥（Calciumphosphatecements，CPC）因其與天然骨組織成份相同，且具有優(yōu)良的生物相容性，可降解，易成型的優(yōu)點(diǎn)，已被作為骨移植替代材料和BMP的載體材料應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)。然而，CPC材料由于其致密的結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)吸收速度慢，不利于骨組織的長(zhǎng)入，影響了

3、骨組織的爬行替代過程。同時(shí)，由于缺乏多孔結(jié)構(gòu)也限制了其作為支架材料在骨組織工程中的應(yīng)用。事實(shí)上，支架材料的多孔結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是十分必要的。研究表明，骨支架材料的多孔結(jié)構(gòu)對(duì)材料的生物學(xué)性能和機(jī)械性能有著重要的影響。但是，骨支架材料的最佳結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)仍是材料研究和應(yīng)用領(lǐng)域所需要解決的重要問題。
　　孔徑大小是骨生物材料的一項(xiàng)重要結(jié)構(gòu)參數(shù)，這項(xiàng)參數(shù)對(duì)于細(xì)胞的增殖和黏附，以及隨后的骨組織形成有著重要的影響。同時(shí)，考慮到BMP和骨移植材料的結(jié)合應(yīng)用，

4、必須明確載體材料孔徑在調(diào)節(jié)復(fù)合的BMP的骨誘導(dǎo)活性，促進(jìn)骨形成中的作用，以及孔徑和BMP在改善骨移植材料成骨性和降解性中的協(xié)同作用。但是，有關(guān)這方面的研究較少。本課題采用鹽析法制備了具有良好貫通的不同孔徑大小的多孔CPC材料。在成功制備本實(shí)驗(yàn)所需材料的前提下，復(fù)合人工合成的重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2，rhBMP-2)，通過比較不同孔徑多孔CPC材料的體內(nèi)骨誘

5、導(dǎo)活性和降解性，研究BMP和材料孔徑在影響載體材料的成骨性和降解性中的協(xié)同作用，探討通過改變載體材料孔徑從而調(diào)節(jié)BMP的骨誘導(dǎo)活性和材料降解性的可行性，為設(shè)計(jì)合理的材料結(jié)構(gòu)提供理論參數(shù)。
　　本課題主要從以下四個(gè)方面進(jìn)行研究：
　　1.復(fù)合rhBMP-2的多孔型與致密型活性CPC異位成骨比較研究
　　本研究采用鹽析法制備了一種多孔型CPC材料并復(fù)合rhBMP-2，與致密型CPC/rhBMP-2復(fù)合材料比較。將兩種材料植

6、入小鼠下肢肌肉內(nèi)，并采用Micro-CT、組織學(xué)觀察和熒光雙標(biāo)法分析兩種活性材料的體內(nèi)骨誘導(dǎo)活性和降解性，探索材料的多孔結(jié)構(gòu)在影響成骨生長(zhǎng)因子的使用效果及改變材料降解性中的作用。結(jié)果表明，與致密型材料相比，多孔型CPC材料復(fù)合rhBMP-2后表現(xiàn)出了更好的成骨活性，骨形成時(shí)間更早，各時(shí)間點(diǎn)所形成骨量更多，并且新骨形成的速率更快。這一現(xiàn)象可能與多孔結(jié)構(gòu)更有利于rhBMP-2的釋放，從而誘導(dǎo)更多的骨形成，以及優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性促進(jìn)骨向材料內(nèi)的長(zhǎng)

7、入有關(guān)。另外，與致密型材料相比，復(fù)合rhBMP-2的多孔型CPC材料在體內(nèi)表現(xiàn)出更快的降解性。以上結(jié)果提示，材料的多孔結(jié)構(gòu)能夠影響成骨生長(zhǎng)因子的使用效果及改變材料的降解性。
　　2.孔徑大小對(duì)多孔磷酸鈣人工骨材料降解性能的影響研究
　　本實(shí)驗(yàn)的目的是研究孔徑這一多孔結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)對(duì)材料降解性的影響，探討通過改變支架材料孔徑從而調(diào)節(jié)材料降解性和力學(xué)性能的可行性。實(shí)驗(yàn)采用鹽析法制備了三種孔徑不同但孔隙率相同的多孔CPC材料，并進(jìn)

8、行體外PBS浸泡試驗(yàn)和體內(nèi)植入，對(duì)比研究了不同孔徑材料在兩種環(huán)境下所表現(xiàn)出的降解性的不同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外試驗(yàn)中，大孔徑材料表現(xiàn)出更好的溶解性，表現(xiàn)在質(zhì)量損失更快，孔隙率的增加和力學(xué)強(qiáng)度的下降更為明顯。但是，材料在體外介質(zhì)中的降解是非常緩慢的。與體外不同的是，材料植入到體內(nèi)后降解加快，而且孔徑對(duì)于材料降解性的影響結(jié)果也不同。在體內(nèi)，小孔徑的材料表現(xiàn)出了更為明顯的降解。這一結(jié)果提示，孔隙率一致的情況下，通過改變支架材料的孔徑可以一定程度上

9、調(diào)節(jié)材料的降解性和力學(xué)性能，但是這種影響在體外溶解介質(zhì)中和體內(nèi)環(huán)境是不同的。
　　3.不同孔徑CPC/rhBMP-2復(fù)合材料異位誘導(dǎo)成骨活性的比較研究
　　本實(shí)驗(yàn)的目的是研究孔徑對(duì)復(fù)合rhBMP-2的多孔CPC材料體內(nèi)的骨誘導(dǎo)活性的影響。仍采用與前兩項(xiàng)研究相同的方法制備了三種不同孔徑的多孔CPC材料，孔徑范圍分別是200-300μm、300-450μm和450-600μm。通過比較rhBMP-2在三種不同孔徑CPC載體材料中

10、的體外釋放動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)，載體材料孔徑大小影響復(fù)合在材料上的rhBMP-2的釋放，早期大孔徑載體材料內(nèi)的rhBMP-2的突釋現(xiàn)象更為明顯，而小孔徑材料釋放持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。將復(fù)合rhBMP-2三種孔徑的載體材料植入肌肉內(nèi)，采用Micro-CT、組織學(xué)觀察和組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析對(duì)比了不同孔徑載體材料上的rhBMP-2骨誘導(dǎo)活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間點(diǎn)，不同孔徑載體材料復(fù)合rhBMP-2后誘導(dǎo)形成的骨組織的分布和數(shù)量有明顯差異。植入早期，形成的骨組織主

11、要分布在材料外周。與小孔徑材料相比，孔徑大的載體材料外周包繞的新生骨組織容量更多。植入后期，相對(duì)于大孔徑材料，孔徑小的載體材料有更多的孔隙內(nèi)有骨組織和類骨組織形成，而且孔隙內(nèi)骨形成的速率較高，骨小梁較寬。以上結(jié)果提示，載體材料的孔徑大小能夠影響rhBMP-2的釋放和體內(nèi)誘導(dǎo)成骨活性。相對(duì)于大孔徑材料，小孔徑的載體材料更能夠維持rhBMP-2的誘導(dǎo)骨形成能力持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。
　　4．不同孔徑多孔CPC/rhBMP-2材料修復(fù)兔松質(zhì)骨缺

12、損的比較研究
　　本研究的目的是評(píng)價(jià)骨環(huán)境中，孔徑對(duì)復(fù)合rhBMP-2的多孔CPC材料的骨形成和降解性的影響，探討孔徑大小和rhBMP-2在調(diào)節(jié)載體材料成骨性和降解性中的協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)將制備的三種不同孔徑（孔徑范圍分別是200-300μm、300-450μm和450-600μm）的圓柱狀多孔CPC材料，復(fù)合rhBMP-2后植入兔松質(zhì)骨缺損中，并與單純材料作對(duì)比。于植入后4、12、20周行DR-X線、Micro-CT、組織學(xué)及組織

13、形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有材料組的骨形成量和降解材料面積百分比隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。含有rhBMP-2的材料骨形成量、骨形成速度和降解速率均高于單純材料組。不論是復(fù)合rhBMP-2的材料組還是單純材料組，小孔徑材料均具有較多的新生骨組織形成和較快的降解速率。所有材料中，200-300μmCPC/rhBMP-2材料的骨形成量最多，降解最快，20周時(shí)，材料已降解了52.5％。此時(shí)，含有rhBMP-2的材料內(nèi)骨組織面積較12周時(shí)有所下降，