布魯氏菌BLS-L7-L12重組亞單位疫苗的初步研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)(簡稱布病)是由布魯氏菌(BrLicella．spp)引起的人、畜共患傳染病。世界上有170多個國家和地區(qū)有人、畜布病存在和流行。在我國布病已波及28個省市區(qū)，并且近年呈死灰復燃，給畜牧業(yè)和人類的健康帶來嚴重危害，因此防控布魯氏菌病形勢相當嚴峻。 布魯氏菌屬包括新發(fā)現(xiàn)的海洋哺乳動物種在內(nèi)，有7種21個生物型，感染人的主要有牛、羊、豬三種。布魯氏菌是革蘭氏陰性菌，兼性寄生于巨噬細胞內(nèi)，從而逃避宿

2、主的免疫清除，它主要引起人的波狀熱和慢性感染，造成反芻動物不育和流產(chǎn)等，同時它又是一種潛在的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑?？刂撇剪斒暇鞑リP鍵是進行疫苗接種，目前在一些國家使用的弱毒疫苗(牛型19號疫苗以及羊Rev.1弱毒苗)對預防布魯氏菌病能夠起到一定的作用，但弱毒疫苗接種與感染難以鑒別以及存在潛在安全性的問題，因此研制新一代布魯氏菌病疫苗成為生命科學的重要課題。 當前布魯氏菌新型疫苗的研究主要集中在毒力相關基因缺失的突變株疫苗和重

3、組亞單位疫苗兩個領域。突變株疫苗雖然有較好的保護性，但安全性和穩(wěn)定性仍需進一步的評價，并且可能有毒力返強的現(xiàn)象。布魯氏菌重組亞單位疫苗能產(chǎn)生一定的免疫原性和免疫保護性，但保護效果不完全。于是我們認為，采用多價保護性抗原分子和利用不同的抗原提呈系統(tǒng)開展的布魯氏菌重組亞單位疫苗的研究，可能為新型布魯氏菌疫苗提供一條可行途徑。 本研究首先從布魯氏菌M16中克隆L7/L12和BLS基因，并進一步用重疊延伸PCR擴增BLS-L7/L12基

4、因，分別構建在pET32a表達載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌8L21，經(jīng)誘導表達、純化相應重組蛋白，鋁鹽吸附制備L7/L12、BLS和BLS-L7/L12重組蛋白疫苗；同時將3種蛋白抗原基因克隆到真核表達載體pVAX1上，轉(zhuǎn)染COS-7細胞后證明有目的蛋白表達，大提質(zhì)粒制備L7/L12、BLS和BLS-L7/L12 DNA疫苗；并利用依賴asd基因的宿主-載體平衡致死系統(tǒng)，把BLS-L7/L12基因轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌，構建以減毒沙門氏菌為載體的B

5、LS-L7/L12蛋白疫苗和基因疫苗。 隨后將候選的BLS-L7/L12蛋白疫苗、DNA疫苗和減毒沙門氏菌為載體的蛋白疫苗和基因疫苗疫苗分別免疫Balb/c小鼠，三免后ELISA測定結果顯示，各實驗組均能誘導產(chǎn)生特異性抗體；抗體亞型分類實驗表明重組蛋白疫苗誘導產(chǎn)生Th2型為主的免疫應答，DNA疫苗及以減毒沙門氏菌為載體的疫苗產(chǎn)生Th1型為主的免疫應答；MTT法測定免疫Balb/c小鼠T淋巴細胞增殖發(fā)現(xiàn)DNA組及以減毒沙門氏菌為載

6、體的疫苗組脾臟T淋巴細胞增殖反應增強，而重組蛋白疫苗組卻無顯著變化；FCM測定疫苗免疫Balb/c小鼠淋巴細胞亞群分類，CD4<'+>/CD8<'+>DNA疫苗組及減毒沙門氏菌組減少，而重組蛋白組有升高趨勢；ELISPOT檢測特異性活化的可分泌IFN-γ的CD8<'+>T細胞數(shù)，DNA免疫組的斑點數(shù)顯著多于對照組。牛種布魯氏菌544A強毒株對免疫Balb/c小鼠攻毒實驗證明我們所構建的疫苗都具有一定的免疫保護性，DNA疫苗好于蛋白疫苗，