TAT介導的載多西他賽混合膠束的研究.pdf

1、多西他賽(docetaxel，DTX)是由歐洲紅豆杉屬植物漿果紫杉(Europeanyewtree，Taxusbaccata)的針葉中提取或半合成的第二代紫杉烷類抗腫瘤化合物，其通過阻斷微管系統(tǒng)進而阻斷有絲分裂期及有絲分裂間期的細胞功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。多西他賽作為一種高效的細胞毒類藥物已廣泛用于實體瘤如早期或轉移性乳腺癌、非小細胞肺癌、胃癌等的治療。然而多西他賽也存在較多毒副作用，如會導致中性粒細胞減少、骨骼肌毒性外周神經(jīng)病變及超敏反

2、應等，這些都影響了其在臨床上的應用。原因主要有以下幾個方面，一是多西他賽在體內(nèi)通過非特異性方式分布，無腫瘤靶向性;二是多西他賽為多環(huán)結構，在水中難溶，目前臨床上應用的上市劑型是含高濃度的非離子型表面活性劑吐溫-80和乙醇(50∶50，V/V)的注射劑，但此溶劑體系會引起超敏反應，并且能誘導輸液時使用的聚氧乙烯(PVA)袋產(chǎn)生泄露;三是已有報道顯示乳腺癌患者對多西他賽存在固有性或獲得性多藥耐藥性，嚴重降低了藥物的療效。因此，需要選用合適的

3、載藥系統(tǒng)以提高多西他賽的溶解度，增加靶向性，降低藥物的毒副作用并逆轉其多藥耐藥性。
　　 共聚物膠束作為一種新型的藥物載體，是一類由親水鏈與疏水鏈在水溶液中自發(fā)排列形成的二嵌段(AB)或三嵌段(BAB)核殼型結構的兩親性聚合物。其疏水片段形成膠束內(nèi)核，親水片段形成膠束外殼，內(nèi)核可以作為疏水性藥物的儲庫增溶藥物。由于共聚物膠束在納米載藥體系中的突出優(yōu)勢，近些年來已引起人們的廣泛研究，尤其是混合膠束，它可集合多種不同類型單一聚合物膠

4、束的優(yōu)點，穩(wěn)定性顯著增加。因此，本課題選用了兩種無毒、生物可降解并具有逆轉藥物多藥耐藥性的共聚物材料，制備了兩種混合膠束，增加了多西他賽的溶解度、腫瘤靶向性及進入細胞內(nèi)的藥量。一是載多西他賽的混合膠束;二是細胞穿膜肽TAT介導的載多西他賽的混合膠束，其中TAT可攜帶載體有效地進入細胞內(nèi)，從而使得膠束在具有靶向腫瘤部位特定的同時，增加了藥物進入細胞內(nèi)發(fā)揮藥效的量，以進一步提高治療效果。論文將對兩種混合膠束制劑進行系統(tǒng)的理化性質(zhì)、體外細胞毒

5、性以及體內(nèi)藥物代謝動力學行為和體內(nèi)組織分布研究，并對其在腫瘤治療中的應用前景進行探討。課題的主要實驗方法及結果如下:
　　 1.載多西他賽的MPP/P123混合膠束制劑的研究
　　 本實驗選用薄膜分散法制備載多西他賽的混合膠束，在單因素考察的基礎上，以星點-效應面法設計并優(yōu)化實驗結果，篩選最優(yōu)的處方及制備工藝。為增加保存過程中的穩(wěn)定性，以甘露醇為凍干保護劑，采用冷凍干燥法制備凍于制劑。同時還對膠束制劑凍干前后的理化性質(zhì)進

6、行了考察，包括膠束的外觀形態(tài)、粒徑及其分布、zeta電勢、包封率及載藥量。
　　 芘探針法測得混合膠束的CMC為0.0100mg/mL，小于P123的CMC(0.0162mg/mL)。凍干前后，透射電子顯微鏡觀察膠束的均呈球形或類球形，且表面光滑無粘連;動態(tài)光散射法測得粒徑分別為22.7nm和27.3nm，多分散系數(shù)都較小;zeta電勢為-5.46mV和-4.65mV，呈現(xiàn)弱的電負性;混合膠束的包封率高達97.25％，載藥量為2

7、.3％。
　　 2.TAT介導的載多西他賽混合膠束的研究
　　 首先利用mal-PEG-OH與D，L-丙交酯進行丙交酯開環(huán)聚合反應，合成mal-PEG-PLA聚合物，然后與TAT反應制備TAT-PEG-PLA。將生成的產(chǎn)物和MPP、P123以適當?shù)谋壤苽銽AT介導的載有多西他賽的混合膠束（TAT-MM/DTX）。使用透射電子顯微鏡觀察膠束呈球形或類球形;測得平均粒徑為30.17nm，粒徑分布較窄;Zeta電勢為5.84

8、±0.55mV。體外釋放實驗中，本實驗分別模擬正常血液及腫瘤部位的pH值，選用pH7.4和pH5.0的緩沖液為釋放介質(zhì)，研究制劑的釋放速率。結果顯示MM/DTX及TAT-MM/DTX兩種混合膠束制劑的體外釋放曲線相似，并且與多帕菲(R)相比，混合膠束制劑有明顯的緩釋作用。在pH5.0條件下兩種膠束制劑的釋放速率快于pH7.4時的釋放速率，由此可知，藥物從膠束制劑中釋放顯示了一定的pH依賴性。
　　 3.混合膠束體外抗腫瘤評價

9、r>　　 本實驗采用MTT法研究了多帕菲(R)、MM、TAT-MM膠束對人乳腺癌細胞(MCF-7)、多藥耐藥的人乳腺癌細胞(MCF-7/MDR)及人肝癌細胞(HepG2)的細胞毒性作用。與多帕菲(R)相比，兩種膠束制劑的抗腫瘤能力明顯增強，抗腫瘤活性為TAT-MM/DTX膠束＞MM/DTX膠束＞多帕菲(R);多西他賽原料藥、多帕菲(R)、MM/DTX及TAT-MM/DTX的半數(shù)抑制濃度分別為，MCF-7:5.56±0.51、1.94±

10、0.17、0.7973±0.08、0.444±0.03μg/mL;HepG-2:10.29±0.62、4.82±0.39、1.91±0.15、0.61±0.05μg/mL;MCF-7/MDR:58.13±3.92、36.37±2.67、5.50±0.42、1.98±0.11μg/mL。流式細胞實驗結果顯示，三種細胞對TAT-MM膠束的攝取量明顯高于MM。
　　 4.混合膠束給藥系統(tǒng)的體內(nèi)研究
　　 兔子靜脈注射多帕菲(R

11、)及MM/DTX、TAT-MM/DTX膠束三種制劑后，以DAS2.0軟件分析各個時間點血藥濃度結果顯示，三種制劑在兔子體內(nèi)均符合二室模型，藥動學方程分別為c=86628e-44.6t+5843e-1.57t，c=12349e-10.95t+4150e-0.558t，c=6542e-7.91t+4150e-0.478t，與多帕菲(R)的ACU(8064ng/L/h)相比，MM/DTX、TAT-MM/DTX兩種膠束制劑的ACU(16604n

12、g/L/h、13815ng/L/h)明顯增大;同時兩種膠束制劑的MRT(9.754h、6.81h)均大于多帕菲(R)的MRT(2.454h)。因此，由實驗可知，與多帕菲(R)相比，靜脈注射給藥后，MM/DTX、TAT-MM/DTX兩種膠束制劑均能延長藥物在體內(nèi)的滯留時間，具有緩釋的作用。
　　 動物體內(nèi)的組織分布通過裸鼠體內(nèi)活體成像實驗測定，結果表明，通過裸鼠尾靜脈注射給予MM/DiR、TAT-MM/DiR膠束后，制劑均可快速分

13、布到腫瘤部位，且隨著時間的延長，肝臟處的熒光強度逐漸減弱，腫瘤部位的熒光強度逐漸增強，說明藥物蓄積在肝臟形成的藥物儲庫，緩慢釋放出來，并濃集于腫瘤部位。因此，MM/DTX、TAT-MM/DTX兩種膠束制劑有明顯的腫瘤靶向性，可極大地降低藥物對正常組織器官的毒性，在腫瘤疾病的治療中有重要臨床意義。
　　 綜上所述，本課題制備的多西他賽混合膠束制備工藝簡單，重現(xiàn)性及穩(wěn)定性良好，大大提高了多西他賽的溶解度，并可被動靶向于腫瘤組織，同時