多西他賽-羧甲基殼聚糖結(jié)合物膠束的研究.pdf

1、癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，近年來癌癥的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出明顯上升趨勢，化療是目前癌癥治療的主要手段之一。多西他賽(Docetaxel，DTX)為臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物，被廣泛用于包括卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等在內(nèi)的多種腫瘤的治療。由于DTX溶解性較差，目前上市制劑如泰索帝(@)(Taxotere(@))和多帕菲(@)(Duopafei(@))等均以高濃度的非離子表面活性劑Tween-80作為增溶劑;DTX自身在體內(nèi)

2、的非選擇性分布和增溶劑的使用使得該制劑毒副作用較大，限制了其臨床應(yīng)用。
　　 近年來，藥物-聚合物結(jié)合物應(yīng)用于難溶性抗腫瘤藥物遞送受到藥學(xué)研究者越來越多的關(guān)注。將小分子難溶性藥物通過可降解的化學(xué)鍵和水溶性大分子聚合物共價連接制備的藥物-聚合物結(jié)合物具有兩親性，可以在水性介質(zhì)中自組裝形成以難溶性藥物為疏水內(nèi)核，水溶性聚合物為親水外殼的膠束。與難溶性抗腫瘤藥物增溶制劑相比，抗腫瘤藥物-聚合物結(jié)合物膠束具有:載藥量高、避免有毒增溶劑使

3、用、延長藥物在體內(nèi)的半衰期、在遞送過程中無藥物突釋風(fēng)險、可通過EPR效應(yīng)靶向于腫瘤組織等諸多優(yōu)點。聚谷氨酸-紫杉醇結(jié)合物(polyglutamicacid-paclitaxelconjugates，PGA-PTX)的研究已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅲ期階段，研究結(jié)果表明，與PTX制劑Taxol(@)相比，PGA-PTX結(jié)合物的副反應(yīng)更小、治療效果更優(yōu)、且易于給藥、病人順應(yīng)性更好。因此，藥物-聚合物結(jié)合物用于難溶性抗腫瘤藥物遞送是目前藥劑學(xué)領(lǐng)域研究熱點之

4、一。
　　 聚合物載體材料的選擇對于藥物-聚合物結(jié)合物的設(shè)計和制備十分關(guān)鍵。羧甲基殼聚糖(Carboxymethylchitosan，CMCS)是一種天然大分子多糖衍生物，具有優(yōu)良的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)，CMCS分子中含有很多活性基團(tuán)（氨基、羧基和羥基），便于偶聯(lián)藥物。因此CMCS是合成藥物-聚合物結(jié)合物的理想載體材料之一。本文選用CMCS為聚合物載體和DTX偶聯(lián)制備多西他賽-羧甲基殼聚糖結(jié)合物(Docetaxel-Carbox

5、ymethylchitosanconjugates，DTX-CMCS)，該結(jié)合物在水中可以自組裝形成DTX-CMCS膠束，提高DTX的溶解度，避免Tween-80的使用，同時可利用EPR效應(yīng)增加藥物在腫瘤組織的蓄積。為了進(jìn)一步增加藥物在腫瘤組織中選擇性蓄積能力和抗腫瘤效果，本文選擇靶向因子修飾DTX-CMCS獲得了具有腫瘤主動靶向作用的藥物-聚合物結(jié)合物。研究證明含天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(asparagines-glycine-arg

6、inine，NGR)結(jié)構(gòu)的寡肽可以特異性地和腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞表面上高度表達(dá)的APN/CD13受體結(jié)合。與線性的NGR寡肽相比，環(huán)合NGR寡肽(cNGR)對CD13受體的選擇性和親和性更強。因此，本文選擇cNGR為靶向基因子修飾DTX-CMCS獲得了雙靶向DTX-CMCS-PEG-NGR結(jié)合物(DTX-CPN)，該結(jié)合物可以靶向于CD13過表達(dá)的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，從而實現(xiàn)一種靶向基團(tuán)修飾，雙靶向遞送藥物的效

7、果，有利于進(jìn)一步提高藥物治療作用。
　　 本課題研究內(nèi)容主要包括兩部分:(1)DTX-CMCS結(jié)合物膠束的研究;(2)NGR介導(dǎo)的雙靶向DTX-CPN結(jié)合物膠束的研究。本文對兩種結(jié)合物膠束的理化性質(zhì)、穩(wěn)定性、體外和體內(nèi)抗腫瘤效果以及最大耐受劑量(Maximumtolerateddose，MTD)分別進(jìn)行了評價。主要研究方法和結(jié)果如下:
　　 1.DTX-CMCS結(jié)合物膠束的研究
　　 本文首先制備了DTX-CMC

8、S結(jié)合物膠束(DTX-CMCS膠束)并對其理化性質(zhì)和抗腫瘤效果進(jìn)行了評價。首先，利用丁二酸酐和DTX的2’位羥基反應(yīng)，得到羧基化DTX。然后羧基化DTX在EDC·HCl和sulfo-NHS的催化下和CMCS分子中氨基反應(yīng)，獲得DTX-CMCS結(jié)合物(DTX-CMCS)。反應(yīng)完成后，通過透析除去未反應(yīng)的試劑和有機(jī)溶劑，隨著透析的進(jìn)行，DTX-CMCS在水中自組裝形成以DTX為疏水內(nèi)核，CMCS為親水外層的膠束。通過質(zhì)子核磁共振光譜(1H-

9、NMR)方法對DTX-CMCS結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。采用透射電鏡(Transmissionelectronmicroscopy，TEM)觀察了DTX-CMCS膠束的外觀形態(tài)，動態(tài)光散射技術(shù)(Dynamiclightscattering，DLS)測量了DTX-CMCS膠束的粒徑和電位。此外，通過測量DTX-CMCS膠束與不同介質(zhì)孵育后之后DTX的釋放特性，考察了DTX-CMCS膠束的穩(wěn)定性。采用了噻唑藍(lán)比色法(MTT法)和Hoechst染色的方法

10、考察了不同DTX制劑的體外抗腫瘤效果。在藥效學(xué)研究中，評價了DTX-CMCS膠束在荷黑色素瘤小鼠中的抗腫瘤效果。為了評價DTX-CMCS膠束靜脈注射給藥的安全性，本文還測定了DTX-CMCS膠束和市售制劑Duopafei(@)的最大耐受劑量(Maximumtolerateddose，MTD)。
　　 實驗結(jié)果表明，DTX成功地連接到大分子多糖CMCS上。制得的DTX-CMCS膠束外觀形態(tài)圓整、呈球形且分散性良好，粒徑為127.2

11、±5.6nm，Zeta電位為-25.6±1.7mV，載藥量為20.9±0.7％。穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，DTX-CMCS膠束與不同介質(zhì)孵育后，藥物釋放均較少，其中與血漿孵育48h后，藥物釋放僅為12.46％，這說明該DTX-CMCS膠束在血漿中穩(wěn)定性良好。MTT實驗結(jié)果表明，DTX-CMCS膠束在兩種腫瘤細(xì)胞中(HepG2和B16F10)均顯示出明顯的細(xì)胞毒性(p＜0.01)。細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，DTX-CMCS膠束可有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋

12、亡。體內(nèi)抗腫瘤實驗結(jié)果顯示，DTX-CMCS膠束可以更有效地抑制小鼠黑色素瘤的生長并延長小鼠生存時間，其抗腫瘤效果優(yōu)于Duopafei(@)(p＜0.01)。MTD實驗結(jié)果表明，Duopafei(@)的MTD約為50mg/kg，而DTX-CMCS膠束的MTD≥250mg/kg，這說明與DTX-CMCS膠束的體內(nèi)應(yīng)用安全性將優(yōu)于Duopafei(@)。綜上所述，DTX-CMCS膠束是一種很有應(yīng)用前景的DTX遞送體系，值得進(jìn)一步研究。此外，

13、CMCS理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)優(yōu)良，作為聚合物載體材料有望用于更多抗腫瘤藥物-聚合物結(jié)合物的研究和開發(fā)。
　　 2.NGR介導(dǎo)的雙靶向DTX-CPN結(jié)合物膠束的研究
　　 為了進(jìn)一步增加DTX-CMCS膠束靶向于腫瘤組織的能力，本文選擇cNGR作為靶向因子修飾DTX-CMCS制備了雙腫瘤靶向DTX-CPN膠束并對其理化性質(zhì)和抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。首先，采用兩端活化的PEG(NHS-PEG-NHS)連接cNGR和CMCS制備

14、了靶向載體材料:CMCS-PEG-NGR(CPN)。然后將羧基化DTX通過酰胺鍵和CPN連接，即可獲得DTX-CPN。同時，本文將DTX偶連到CMCS-PEG分子上制備了DTX-CMCS-PEG結(jié)合物(DTX-CP)作為非NGR修飾對照膠束。通過1H-NMR驗證DTX-CPN的結(jié)構(gòu)。由于具有兩親性，DTX-CP和DTX-CPN可在水中自組裝形成以DTX為疏水內(nèi)核、CPN(或CP)為親水外層的膠束。本文采用TEM觀察了DTX-CP和DTX

15、-CPN膠束的外觀形態(tài)，并通過DLS技術(shù)測定了兩種膠束的粒徑和電位。通過測定DTX-CPN膠束在不同介質(zhì)中的藥物釋放情況，考察了該膠束制劑的穩(wěn)定性。為了驗證cNGR修飾的靶向作用，選擇了不同CD13受體表達(dá)程度的細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞攝取實驗。通過細(xì)胞毒性實驗和細(xì)胞凋亡實驗考察了DTX-CPN膠束的體外抗腫瘤效果。采用小鼠黑色素瘤模型評價了DTX-CPN膠束體內(nèi)抗腫瘤效果并與DTX-CP膠束和Duopafei(@)的治療效果進(jìn)行比較。為了評價D

16、TX-CPN膠束靜脈注射給藥的安全性，本文還測定了DTX-CPN膠束的MTD。
　　 本部分成功制備了單純PEG化的DTX-CP和cNGR靶向修飾的雙靶向DTX-CPN。TEM觀察結(jié)果顯示，DTX-CP和DTX-CPN在水中均可自發(fā)形成外觀形態(tài)圓整、球形且分散性良好的膠束。粒徑測量結(jié)果顯示:DTX-CP和DTX-CPN膠束的粒徑分別為130.5±8.2nm和142.9±5.6nm，電位結(jié)果顯示:DTX-CP和DTX-CPN膠束的

17、電位分別為-20.86±1.8mV和-15.57±2.2mV。穩(wěn)定性考察結(jié)果表明兩種膠束在血漿中穩(wěn)定性均良好，與血漿孵育48h之后，藥物釋放分別為10.75±0.41％(DTX-CP)和10.34±0.39％(DTX-CPN)。細(xì)胞攝取實驗結(jié)果表明，cNGR修飾賦予了DTX-CPN膠束主動靶向于CD13陽性細(xì)胞的能力。細(xì)胞毒性結(jié)果表明，DTX-CPN膠束對CD13陽性的B16F10細(xì)胞和HUVEC的細(xì)胞毒性高于同濃度的DTX-CP膠束(

18、p＜0.05)。體內(nèi)抗腫瘤實驗結(jié)果顯示，DTX-CPN膠束能更有效地抑制腫瘤的生長并延長荷瘤小鼠的生存時間，其抗腫瘤效果優(yōu)于DTX-CP膠束和市售制劑Duopafei(@)(p＜0.01)。MTD實驗結(jié)果表明，DTX-CP和DTX-CPN膠束的MTD均介于300～350mg/kg之間，說明兩種結(jié)合物體內(nèi)應(yīng)用安全性良好。綜上所述，雙靶向DTX-CPN膠束能夠有效地靶向CD13陽性的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，抗腫瘤活性高且毒副作用低。