融合蛋白hPTH(1-34)-,ab--HSA的真核表達及活性初步評價.pdf

1、人甲狀旁腺激素(hPTH)是由人甲狀旁腺主細胞分泌的一種單鏈多肽激素，由84個氨基酸組成，是人體內(nèi)調(diào)節(jié)骨代謝的重要激素之一，其類似物已被開發(fā)成為治療骨質(zhì)疏松癥的一系列新型藥物。研究表明，hPTH前34位氨基酸片段hPTH(1-34)保留了天然hPTH幾乎所有可測的生物活性；小分子蛋白與人血清白蛋白(HSA)融合可以顯著延長自身的半衰期。為了提高hPTH生物活性，延長其在人體內(nèi)的半衰期，先將hPTH的前34個氨基酸片段的基因串聯(lián)，之后再與

2、HSA基因融合，合成了二聯(lián)體融合蛋白hPTH(1-34)ab-HSA的基因，將融合基因在畢赤酵母中進行表達，并對得到的融合蛋白進行鑒定、純化和活性初步評價。
　　 設計特異性引物，得到兩個帶有不同5’末端和3’末端延長序列的hPTH(1-34)單體基因片段，重疊PCR技術(shù)將二者拼接成二聯(lián)體，并插入到克隆載體pTG19-T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTG19-T-hPTH(1-34)ab，進行測序。結(jié)果顯示，克隆得到的二聯(lián)體基因片段與理論序

3、列完全一致。重疊PCR技術(shù)體外拼接hPTH(l-34)ab和HSA基因，得到融合蛋白hPTH(1-34)ab-HSA的基因，將其在EcoR I和Not I酶切位點插入到表達載體pPIC9K中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPIC9K-hPTH(1-34)ab-HSA。雙酶切鑒定結(jié)果表明融合基因已經(jīng)成功地插入到表達載體pPIC9K中；測序結(jié)果表明重疊PCR拼接得到的融合基因序列與預期一致。
　　 重組表達質(zhì)粒pPIC9K-hPTH(1-34)

4、ab-HSA經(jīng)Sal I線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，利用G418抗性和誘導表達分析篩選出高產(chǎn)重組菌，利用Western blotting鑒定表達產(chǎn)物，之后進行表達條件的初步優(yōu)化。結(jié)果表明，經(jīng)G418篩選得到能耐受2 mg/mLG418的重組菌五株，進一步的誘導表達篩選得到表達量較高的重組菌兩株；Westernblotting顯示，表達的融合蛋白hPTH(1-34)ab-HSA具有很好的HSA和hPTH抗原性；表達條件優(yōu)化后發(fā)酵液