南美白對(duì)蝦肌肉精氨酸氨肽酶的分離純化及性質(zhì)分析.pdf

1、南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)是當(dāng)今世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的三大蝦類(lèi)之一,因其營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美,深受人們的喜愛(ài)。蝦具有其特征性的風(fēng)味,這種特征性風(fēng)味是由前體物質(zhì)經(jīng)化學(xué)變化產(chǎn)生的,而游離精氨酸是產(chǎn)生特征性蝦風(fēng)味的一種主要前體物質(zhì)。精氨酸氨肽酶(Arginine aminopeptidase,RAP)是一種從 N端特異性切割堿性氨基酸的氨肽酶,廣泛分布于動(dòng)物、植物及微生物中。在動(dòng)物肌肉組織中,RAP能夠與內(nèi)肽酶協(xié)同作用

2、,分解蛋白質(zhì)及多肽產(chǎn)生游離的堿性氨基酸(Arg和Lys),以利于肉及肉制品風(fēng)味的形成。
　　本文以南美白對(duì)蝦為研究對(duì)象,通過(guò)硫酸銨鹽析、DEAE-Sephacel陰離子交換層析、Phenyl-Sepharose疏水層析、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析及hydroxyapatite柱層析從其肌肉中分離純化得到精氨酸氨肽酶,并對(duì)其生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析研究。
　　(1)從350 g南美白對(duì)蝦肌肉中

3、純化得到0.6 mg RAP,得率為7.7％,純化倍數(shù)為1953.3。SDS-PAGE電泳分析表明,RAP的分子量約為100 kDa。
　　(2)利用肽質(zhì)量指紋圖譜對(duì)得到的目的蛋白進(jìn)行鑒定,共得到7個(gè)肽段,含95個(gè)氨基酸殘基,這些片段的序列與豌豆蚜蟲(chóng)(Acyrthosiphon pisum)和斑馬魚(yú)(Danio rerio)氨肽酶的序列相似性分別為100%和77.9%,結(jié)合底物特異性,表明純化得到的酶為精氨酸氨肽酶。
　　(

4、3)南美白對(duì)蝦RAP的最適pH為7.0,最適溫度為30℃,其在低溫及中性或弱酸性條件下酶活性較高,且較為穩(wěn)定。通過(guò)熱失活動(dòng)力學(xué)的方法測(cè)定了該酶的表觀熱失活速率常數(shù),表明溫度越高,其失活的速率越快;微觀熱失活速率常數(shù)的測(cè)定表明該酶在熱失活的過(guò)程中存在底物保護(hù)作用。
　　(4)RAP最易分解熒光底物Arg-MCA和Lys-MCA。此外,對(duì)Leu-MCA也有一定的分解作用,但是對(duì)內(nèi)肽酶的底物沒(méi)有分解。利用雙倒數(shù)作圖法,以Arg-MCA和

5、Lys-MCA為底物,分別測(cè)定RAP的Km值為2.7和4.9μmol/L,kcat/Km值為6.7和4.2μmol-1·L·s-1,進(jìn)一步表明該酶的最適底物是Arg-MCA。
　　(5)氨肽酶的抑制劑 puromycin, bestatin和金屬蛋白酶抑制劑1,10-phenanthroline能夠強(qiáng)烈抑制該酶的活性。此外,金屬螯合劑EDTA和EGTA也能夠部分抑制該酶的活性,但其他類(lèi)型蛋白酶抑制劑(E-64,PMSF,pepst