鯉魚(yú)肌肉脯氨酸內(nèi)肽酶的分離純化及性質(zhì)分析.pdf

1、脯氨酸內(nèi)肽酶(Prolyl endopeptidase，PEP)在自然界的分布廣泛，從多種哺乳動(dòng)物、微生物和植物中已有較多發(fā)現(xiàn)。PEP是一類(lèi)能特異性水解多肽鏈中脯氨酸殘基羧基端肽鍵的內(nèi)切酶，在醫(yī)藥領(lǐng)域和工業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。由于PEP能夠有效的降解富含脯氨酸殘基的多肽類(lèi)物質(zhì)，推測(cè)其與動(dòng)物肌肉中膠原蛋白的新陳代謝有著密切的關(guān)系。但是，迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)于魚(yú)類(lèi)肌肉中PEP的研究報(bào)道極少。
　　 本文以淡水鯉魚(yú)為原料，采用硫酸銨分

2、級(jí)沉淀、DEAE-Sephacel陰離子交換層析、Phenyl-Sepharose疏水層析、DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Hydroxyapatite等方法從鯉魚(yú)肌肉中分離純化得到一種脯氨酸內(nèi)肽酶。SDS-PAGE結(jié)果顯示，鯉魚(yú)PEP為單體結(jié)構(gòu)，分子量為82 kDa。
　　 酶學(xué)性質(zhì)分析表明，PEP的最適pH為6.0，當(dāng)pH在5.0-8.0之間時(shí)，有較好的穩(wěn)定性。酶的最適溫度為35℃，其熱穩(wěn)定性

3、較差。熱失活動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，自由酶的熱失活速度常數(shù)(k+0)明顯大于酶與底物結(jié)合物的失活速度常數(shù)(k'+0)，表明底物對(duì)該酶的熱失活作用具有一定保護(hù)作用。在pH6.0的條件下，PEP在35℃和40℃時(shí)半衰期分別為105 min和10 min。
　　 不同蛋白酶抑制劑對(duì)酶活性影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEP的特異抑制劑SUAM-14746對(duì)酶活性具有強(qiáng)烈的抑制作用，絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF和Pefabloc SC)能夠部分抑

4、制酶的活性，而其他的絲氨酸蛋白酶抑制劑(LBTI，Aprotinin，Benzamidine和Leupeptin)對(duì)酶的活性沒(méi)有影響，金屬蛋白酶抑制劑(EDTA和EGTA)和半胱氨酸蛋白酶抑制劑(E-64)均沒(méi)有表現(xiàn)出抑制作用。以上結(jié)果表明，PEP是一種特異性的絲氨酸蛋白酶。
　　 以Suc-Gly-Pro-MCA為底物，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和kcat值，結(jié)果顯示鯉魚(yú)PEP的Km為8.

5、33μmol/L，kcat為1.71 S-1。底物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEP能夠特異分解肽鏈羧基端含有脯氨酸殘基的熒光底物以及肽鏈中含有脯氨酸殘基的小肽(Neurotensin和Bradykinin-Potentiator B)，這一結(jié)果表明了鯉魚(yú)PEP可能是參與魚(yú)肉膠原蛋白降解的一種重要蛋白酶。
　　 肽指紋質(zhì)譜分析得到134個(gè)氨基酸殘基，與海綿(Amphimedon queenslandica)PEP的同源性為100%；與斑