藍圓鲹肌肉脯氨酸內(nèi)肽酶及其內(nèi)源性抑制劑的研究.pdf

1、脯氨酸內(nèi)肽酶（Prolyl endopeptidase，PEP）屬于絲氨酸蛋白酶家族中的一種特殊的切割多肽鏈中脯氨酸殘基羧基端的內(nèi)切酶，廣泛存在于動物、植物和微生物等生物體內(nèi)。PEP參與生物體的多種生理、病理過程，并在醫(yī)藥領(lǐng)域得到了一定的應(yīng)用。但是，國內(nèi)外對于魚類PEP的研究報道還比較少，特別是PEP如何參與魚類肌肉生理變化過程還未見報道。鑒于此，本研究從藍圓鲹肌肉中分離純化出PEP并對其性質(zhì)進行了相關(guān)研究，進一步探索了PEP的內(nèi)源性抑

2、制劑，以期為揭示脯氨酸內(nèi)肽酶在魚類肌肉中的功能特性奠定理論基礎(chǔ)。
　　通過硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sephacel陰離子交換層析、Phenyl-Sepharose疏水層析和Q-Sepharose陰離子交換層析等方法從藍圓鲹肌肉中分離純化得到一種脯氨酸內(nèi)肽酶。SDS-PAGE結(jié)果顯示藍圓鲹PEP分子量約為82 ku。對PEP的肽指紋質(zhì)譜分析得到169個氨基酸殘基，與墨西哥鯛魚（Neolamprologus brichardi）PE

3、P的同源性為98.8％，證明純化的蛋白為脯氨酸內(nèi)肽酶。
　　酶學(xué)性質(zhì)分析表明，PEP的最適溫度和最適pH分別為35℃和6.0，且在低溫與pH5.0-7.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定。通過熱失活動力學(xué)方法測定該酶表觀熱失活速度常數(shù)可知，在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶促反應(yīng)速度提高，酶失活所需要的時間也變短。底物特異性研究顯示PEP能夠特異分解肽鏈羧基端含有脯氨酸殘基的熒光底物，而對其他底物則基本不分解。PEP的特異性抑制劑SUAM-147

4、46和絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF可有效抑制PEP的活性，而其他蛋白酶抑制劑則對PEP沒有抑制作用，表明PEP是一種特異性的絲氨酸蛋白酶。
　　將藍圓鲹PEP分別與三個合成的魚類膠原蛋白小肽進行反應(yīng)，利用反相高效液相色譜進行分離，結(jié)果顯示PEP能夠水解分子量小于30個氨基酸殘基的膠原蛋白小肽。電噴霧質(zhì)譜分析結(jié)果顯示PEP的水解位點位于脯氨酸殘基的羧基端。因此推測，PEP參與到魚肌肉生理變化過程中，協(xié)同金屬蛋白酶，通過特異性切割脯氨酸

5、殘基的羧基端降解膠原蛋白小肽。PEP是與魚膠原蛋白新陳代謝密切相關(guān)的一種重要蛋白酶。圓二色譜掃描結(jié)果顯示，PEP是一種以β折疊為主的蛋白質(zhì)。
　　進一步通過熱處理、硫酸銨鹽析、Q-Sepharose陰離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析和Capto Q陰離子交換層析等步驟從藍圓鲹肌肉中分離純化出一種PEP的內(nèi)源性抑制劑。SDS-PAGE顯示其分子量約為16 ku。對其進行了兩次肽指紋質(zhì)譜分析，結(jié)果與半滑舌鰨（

6、Cynoglossus semilaevis）核苷二磷酸激酶A和無須鱈魚（ Macruronus novaezelandiae）核苷二磷酸激酶B同源性分別達到100%和94%，表明所純化的PEP內(nèi)源性抑制劑是核苷二磷酸激酶。該抑制劑具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，在高達100℃下加熱30 min抑制活性也可以保持70%以上。在pH4.0-12.0的范圍內(nèi)抑制活性變化很小，但在pH<3.0的條件下穩(wěn)定性變差。該抑制劑對PEP有競爭性可逆抑