人脯氨酸異構(gòu)酶CYPJ的功能探討及其與CYPA的小分子抑制劑篩選.pdf

1、親環(huán)素蛋白(cyclophilin，CYP)屬于脯氨酸異構(gòu)酶(PPIase)超家族，能夠催化脯氨酰多肽和脯氨酰蛋白的順反結(jié)構(gòu)互變，其活性能夠被免疫抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)抑制。親環(huán)素蛋白在植物、細(xì)菌、昆蟲、真菌和哺乳動物中廣泛存在，并且在進(jìn)化中具有高度的結(jié)構(gòu)保守性。隨著對親環(huán)素家族成員功能研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明親環(huán)素成員在細(xì)胞調(diào)亡、腫瘤、炎癥、病毒感染等病理過程中都發(fā)揮著重要作用。 通過電子差異顯示分析，本實驗室鑒

2、定到一條肝癌上調(diào)表達(dá)cDNA。序列分析表明，這是一個新的親環(huán)素家族成員。經(jīng)國際基因命名委員會(HUGO)確認(rèn)，該基因被命名為cyclophilin J(CYPJ)。通過測試CYPJ在56對肝癌/癌旁組織樣品中的表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)CYPJ基因的mRNA在71.42％的肝癌組織中上調(diào)表達(dá)。原核表達(dá)的CYPJ蛋白具有脯氨酸異構(gòu)酶活性(PPIase)，并且其活性能被CsA抑制。CYPJ過量表達(dá)可以促進(jìn)L02和SK-Hepl細(xì)胞的克隆形成，而CYP

3、J穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤的生長速度也較對照加快。本文在這些研究的基礎(chǔ)之上對CYPJ與肝癌的相關(guān)性做了進(jìn)一步的研究。用攜帶靶向CYPJ短發(fā)卡狀RNA(sh-RNA)的慢病毒感染肝癌細(xì)胞、敲減CYPJ表達(dá)之后，體外和在體實驗結(jié)果均顯示肝癌細(xì)胞生長速度較對照減慢。CYPJ促腫瘤增殖的機理可能在于它對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)：CYPJ過表達(dá)可以引起細(xì)胞G<,1>期減少，S期增加；相反，用siRNA敲減CYPJ的表達(dá)或者用CsA處理細(xì)胞后則引起細(xì)胞G

4、<,1>期增加，S期減少。這表明CYPJ能夠促進(jìn)細(xì)胞周期由G<,1>期向S期的轉(zhuǎn)變。無論是在mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平，CYPJ過表達(dá)后cyclin D1基因均被上調(diào)，而用siRNA敲減CYPJ表達(dá)或者用CsA處理細(xì)胞均能降低cyclin D1的表達(dá)量。我們用雙熒光素酶報告系統(tǒng)研究了CYPJ對cyclin D1啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，結(jié)果顯示CYPJ能夠激活cyclinD1的的啟動子，并且這種激活依賴于其PPIase活性。進(jìn)一步的分析表明，C

5、YPJ對cyclin D1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能由多條轉(zhuǎn)錄因子的信號通路來介導(dǎo)。 親環(huán)素家族成員在許多病理過程中都發(fā)揮作用，因此篩選親環(huán)素的抑制劑是目前藥物研發(fā)的一個方向，有望從中開發(fā)出具有抗病毒、消炎、抗腫瘤活性的小分子化合物。本文基于CYPA/CYPJ的晶體結(jié)構(gòu)，通過計算機虛擬篩選，從SPECS數(shù)據(jù)庫中得到了若干CYPA/CYPJ的小分子配體。接著利用BIACORE分子相互作用分析儀，實驗驗證了這些小分子化合物與CYPA/CYPJ的

6、親和性，并進(jìn)一步通過α-胰凝乳蛋白酶法檢測了小分子化合物對CYPA/CYPJ的酶活抑制能力。最終我們確定了12個具有PPIase抑制能力的小分子配體。測定了這些小分子配體對HIV-1病毒的抑制作用，當(dāng)用量為10 μM時，F(xiàn)D5，F(xiàn)D8，F(xiàn)D9，F(xiàn)D10和FDl2對HIV-1病毒的抑制能力均高于50％。這些化合物的抗HIV能力與它們的PPIase抑制能力相關(guān)，也與它們對CYPA的親和性相關(guān)。同時，也測定了化合物FDl2對肝癌細(xì)胞株增殖的抑

7、制作用。 本論文用RNAi敲減CYPJ表達(dá)，以及用CsA抑制其活性均能抑制肝癌細(xì)胞的生長，證明CYPJ是一個具有促腫瘤增殖活性的蛋白；也發(fā)現(xiàn)CYPJ能夠促進(jìn)細(xì)胞周期由G<,1>向S期轉(zhuǎn)變，其機制與CYPJ對cyclin D1的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。該研究為深入探討肝癌的發(fā)病機制提供了有價值的候選基因，也為發(fā)展新的肝癌診療方法提供了新的思路。根據(jù)CYPA和CYPJ的晶體結(jié)構(gòu)篩選和鑒定了若干小分子抑制劑，其中5個化合物能夠顯著抑制HIV-1