克雷伯屬和變形桿菌屬16S-23SrRNA基因間區(qū)分析及奶粉中重要要致病菌檢測(cè)基因芯片的研制.pdf

1、本文對(duì)克雷伯氏菌屬和變形桿菌屬的重要菌種的16S-23S rRNA基因間區(qū)(16S-23S rRNA internal transcribed spacer,簡(jiǎn)稱ITS)進(jìn)行了測(cè)序和分析,為利用ITS基因簇中的變異區(qū)進(jìn)行菌種鑒定奠定了基礎(chǔ)。本文還研制了奶粉中重要致病菌檢測(cè)基因芯片,基于ITS和O抗原基因設(shè)計(jì)和篩選了探針,正是ITS序列破譯和分析工作的延伸。
　　 克雷伯氏菌屬和變形桿菌屬的某些種是重要的人類致病菌,能引起多種疾病

2、,危害嚴(yán)重。與此同時(shí),多重耐藥菌株的出現(xiàn)近年來(lái)持續(xù)增加,因此急需積累這些菌的相關(guān)資料,為預(yù)防和控制這些病原菌提供技術(shù)支持。然而,克雷伯屬和變形桿菌屬的屬內(nèi)不同種間差別不大,現(xiàn)有的鑒定手段不易區(qū)分。近年來(lái),ITS因具有更高的分辨率,對(duì)于親緣關(guān)系較近的種屬的區(qū)分比16S rRNA和23SrRNA更具優(yōu)勢(shì)。然而ITS數(shù)據(jù)資源少,滿足不了序列分析特異性的需要。因此我們破譯并分析了克雷伯氏菌屬和變形桿菌屬的間區(qū),探討其可否應(yīng)用于菌種的檢測(cè)和鑒定。

3、
　　 本研究完成了21株克雷伯屬菌株的ITS序列破譯,最終得到了336條ITS序列?？死撞暇鷮俚姆窝卓死撞暇?、臭鼻克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌、解鳥(niǎo)氨酸克雷伯氏菌均含有三種間區(qū)類型:ITSnone,ITSglu和ITSile+ala;而鼻硬結(jié)克雷伯氏菌只含有兩種間區(qū)類型:ITSglu和ITSile+ala。這是目前所知的,在腸桿菌科中只有克雷伯屬有ITSnone類型的間區(qū)?？死撞畬買(mǎi)TS序列種

4、內(nèi)是高度保守的,ITSnone間區(qū)的種內(nèi)序列相似性是0.961-1.000,ITSglu間區(qū)的種內(nèi)序列相似性是0.967-1.000,ITSile+ala間區(qū)的種內(nèi)序列相似性是0.968-1.000?？死撞畬俜N間序列相似性比16s rDNA序列相似性要低,ITSnone是0.775-0.989,ITSglu是0.798-0.997,ITSile+ala是0.712-0.985。在ITSnone序列中,有2個(gè)變異區(qū);在ITSglu中有5個(gè)

5、變異區(qū);在ITSile+ala中有6個(gè)變異區(qū)。這些變異區(qū)主要位于tRNA基因和23S rRNA基因之間和兩個(gè)tRNA基因之間。進(jìn)化分析表明,基于ITS構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)與基于16S rRNA基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)很相似。此外,我們還基于ITS設(shè)計(jì)并篩選得到了特異性擴(kuò)增和檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌和臭鼻克雷伯氏菌。
　　 同樣的,我們破譯了46株變形桿菌的831條ITS序列,分析表明變形桿菌屬有兩種ITS類型:ITSglu和ITSile+ala。根據(jù)

6、ITS類型和長(zhǎng)度,可將變行桿菌ITS序列分為28個(gè)變體,根據(jù)堿基序列相似性,這28個(gè)變體是25個(gè)不同的基因起源。ITS序列種內(nèi)高度保守,序列相似性高達(dá)96.2-100％。所有ITS序列可劃分為三個(gè)保守區(qū)和兩個(gè)變異區(qū),保守區(qū)和變異區(qū)鑲嵌排列,構(gòu)成了“馬賽克”狀I(lǐng)TS序列結(jié)構(gòu)?；谧冃螚U菌ITS的第二個(gè)變異區(qū)(v2)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)比16SrDNA序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)可將潘氏變形桿菌同普通變形桿菌分的更開(kāi)。在ITSglu的變異區(qū)設(shè)計(jì)的特異引物,可特

7、異的將奇異變形桿菌與其他臨床上常見(jiàn)的普通變形桿菌、潘氏變形桿菌、產(chǎn)粘變形桿菌等區(qū)分開(kāi)。
　　 本文分析了克雷伯屬和變形桿菌屬的ITS序列,確定了保守區(qū)和變異區(qū),為基于ITS對(duì)菌種進(jìn)行檢測(cè)和鑒定奠定了基礎(chǔ)。
　　 基因芯片是一種可以對(duì)核酸分子進(jìn)行平行和高通量檢測(cè)的技術(shù),本文以奶粉中常見(jiàn)的坂崎腸桿菌、沙門(mén)氏菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和大

8、腸桿菌O157計(jì)10種致病菌為檢測(cè)對(duì)象研制了病原菌檢測(cè)用基因芯片。利用ITS序列和大腸桿菌O157的O抗原基因簇中的特異基因wzy設(shè)計(jì)引物和探針對(duì)這些菌種進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。樣品經(jīng)過(guò)兩步法前處理后,用裂解液提取基因組,用作PCR模板DNA,然后只加入下游引物進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記,標(biāo)記產(chǎn)物與芯片雜交?？傆?jì)用185株菌(134個(gè)檢測(cè)范圍內(nèi)的菌株和51個(gè)其他種菌株)進(jìn)行了芯片性能評(píng)價(jià),篩選得到了27條特異檢測(cè)。完成了芯片的特異性、靈敏度、多樣品檢測(cè)和雙