除草劑咪唑乙煙酸對玉米根系的對映體選擇性抑制及機(jī)理研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)有機(jī)化合物廣泛存在于環(huán)境中，其手性對映異構(gòu)體在生物有效性、環(huán)境安全性等方面存在不可忽視的差異性，已越來越引起人們的重視。作為我國除草劑支柱產(chǎn)品的咪唑啉酮類除草劑是典型的具有手性結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，其對映體對靶標(biāo)酶乙酰乳酸合成酶(ALS)的離體活性表現(xiàn)出對映體選擇性抑制。然而，酶活抑制的手性差異性機(jī)理尚未被揭示，對映體對植株的差異性抑制研究也尚未見報道。本研究主要內(nèi)容包括：
　　 ⑴建立了最具代表性的咪唑啉酮除草劑咪唑乙煙酸(IM)對

2、映體在高效液相色譜(HPLC)上的手性分離條件。在得到對映體制備樣的基礎(chǔ)上，通過對咪唑乙煙酸的對映異構(gòu)體以及外消旋體作用于玉米幼苗和擬南芥幼苗的研究，一方面觀察作為土施農(nóng)藥，其對首要作用部位根系的生長形態(tài)、亞顯微結(jié)構(gòu)和根毛發(fā)生發(fā)育的選擇性影響，以及植物體內(nèi)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的響應(yīng)與根毛的形成、發(fā)育之間的相互關(guān)系；另一方面，研究其對靶標(biāo)酶乙酰乳酸合成酶活性抑制的對映體選擇性差異及機(jī)理。從這兩方面探明和揭示IM對映體對植物的對映體選擇性抑制及機(jī)理

3、。本文取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑵在高效液相色譜上，采用Chiralpak OJ手性柱，以正己烷/乙醇/乙酸(75/25/0.5，v/v/v)為流動相，基線分離得到IM的對映體。并采用HPLC-CD聯(lián)用技術(shù)，確定對映體的出峰次序和CD光譜圖。通過八區(qū)律確定了IM兩個對映體的絕對構(gòu)型分別為S-(+)-IM和R-(-)-IM。同時以所建立的對映體分離方法制備了對映體標(biāo)樣。
　　 ⑶通過除草劑IM對映體(濃度為100，2

4、00，400和800μg L-1)作用于玉米和擬南芥幼苗的試驗發(fā)現(xiàn)，IM顯著抑制植株地上部和根系的生長，使植株表現(xiàn)出明顯的毒害癥狀，包括葉子萎黃、生長停滯以及根尖潰爛等。IM對生長的抑制作用呈對映體選擇性，R-(-)-IM的毒害作用最強(qiáng)，S-(+)-IM的生長抑制作用最弱，外消旋的抑制能力介于左右旋之間。
　　 ⑷當(dāng)處理濃度為100，200，400和800μg L-1，IM對玉米根系形態(tài)呈對映體選擇性影響，根直徑增粗，而根表面積

5、和體積顯著減小，側(cè)根數(shù)也顯著減少，根系活力顯著下降。200和400μg L-1IM對映體分別選擇性抑制玉米和擬南芥根毛的生長，根毛長度明顯變短，數(shù)量顯著減少，根毛細(xì)胞破損。通過轉(zhuǎn)基因擬南芥DR5∷GFP觀察根部的生長素水平發(fā)現(xiàn)，IM處理降低了生長素含量，在受抑制強(qiáng)烈的R-(-)-IM中，根毛中熒光強(qiáng)度比S-(+)-IM處理的弱，表明生長素含量低。添加外源生長素處理，可緩解根毛生長的抑制狀況。根中生長素含量的降低是IM毒害根毛生長的重要原

6、因。400μg L-1IM處理對根冠細(xì)胞器亞顯微結(jié)構(gòu)具有對映體選擇性毒害作用，導(dǎo)致根尖細(xì)胞核呈不規(guī)則形狀，而且核仁消失，其他細(xì)胞器數(shù)量減少，個體變小。其中，線粒體膜解體，線粒體嵴也變得模糊不清；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜斷裂；高爾基體膜囊腫脹，小液泡消失。IM處理還導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞壁增粗，纖維化，失去彈性，其中平衡石的亞顯微結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致根系橫向生長。
　　 ⑸施入土壤或殘留的除草劑對植株的對映體選擇性毒害首先表現(xiàn)在對根系的快速抑制，其通過對根系

7、形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變、對根細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞、對根系和根毛生長的抑制以及生理活性抑制，最終導(dǎo)致對植株的毒害。IM對離體和活體ALs酶活性均存在對映體選擇性抑制，R-(-)-對映體的抑制作用最強(qiáng)，S-(+)-對映體的抑制作用最弱，(±)-IM介于左右旋之間。離體酶活性抑制情況比較復(fù)雜，隨著處理濃度變化，左右旋抑制差異呈規(guī)律性變化，當(dāng)IM濃度為40μg L-1時，R-(-)-對映體對離體酶活的抑制率達(dá)到5.6％，而S-(+)-對映體對酶活僅有微弱

8、的抑制，抑制率為0.2％，右旋和左旋抑制能力相差25倍之多。隨著濃度的升高，抑制作用越加顯著，左右旋的差異也逐漸減少。濃度升高至200μg L-1，R-(-)-IM的抑制率為28.9％，S-(+)-和(±)-IM為3.8％和19.8％。R-(-)-對映體和S-(+)-對映體的抑制率差異降低至7倍。當(dāng)IM濃度低于1 mg L-1，S-(+)-IM的抑制作用上升緩慢，而R-(-)-IM的抑制卻已很強(qiáng)烈，1 mg L-1時已經(jīng)達(dá)到70.4％。

9、隨著的濃度呈倍數(shù)升高，S-(+)-對映體的抑制作用也顯著提高，在5mg L-1和25 mg L-1，S-(+)-，R-(-)-和(±)-IM三者都對酶活有很高的抑制，左右旋的差異僅為1倍多。；100，200，400和800μg L-1的IM處理后，左右旋對活體酶活抑制的差異在2倍左右，與植株生長抑制情況一致。表明活體酶活與生長情況有更大的相關(guān)性。分子對接實驗表明IM對映體與ALS相互作用存在立體選擇性，R-(-)-IM才是與ALS結(jié)合的

10、優(yōu)勢構(gòu)型。因此R-(-)-IM比S-(+)-IM對ALS的抑制作用更強(qiáng)。
　　 ⑹農(nóng)藥的手性研究、單一光學(xué)活性異構(gòu)體生產(chǎn)上的突破，是減少生態(tài)環(huán)境污染和推行綠色農(nóng)業(yè)的必然要求。為此，在手性層面上深入研究對映異構(gòu)體的活性、作用機(jī)理等問題具有重要現(xiàn)實意義。本文通過對咪唑乙煙酸的對映體以及外消旋體作用于玉米和擬南芥幼苗根系及靶標(biāo)酶的研究，探明和揭示IM對映體對植物的對映體選擇性抑制及機(jī)理，為客觀評價咪唑啉酮類除草劑的生物活性、生產(chǎn)上如何