調(diào)控光滑球擬酵母碳代謝流促進(jìn)α-酮戊二酸過(guò)量積累.pdf

1、本論文以一株能在胞外大量積累丙酮酸和α-酮戊二酸的光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)四重維生素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株CCTCC M202019為出發(fā)菌株，以碳主流代謝途徑中的α-酮酸脫氫酶系(丙酮酸脫氫酶系和α-酮戊二酸脫氫酶系)為研究對(duì)象，結(jié)合生化工程和基因工程手段，調(diào)控碳代謝流進(jìn)入TCA循環(huán)，同時(shí)阻斷α-酮戊二酸的進(jìn)一步代謝途徑，使碳代謝流從過(guò)量積累丙酮酸轉(zhuǎn)向過(guò)量積累α-酮戊二酸，提高α-酮戊二酸對(duì)丙酮酸的碳摩爾比。本論

2、文主要結(jié)論如下:
　　 1.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)論，選擇過(guò)氧化氧和甲氨喋呤作為α-酮戊二酸脫氫酶的有效抑制劑，在T.glabrata發(fā)酵生產(chǎn)α-酮戊二酸的過(guò)程中:(1)添加6 mM過(guò)氧化氫，α-酮戊二酸產(chǎn)量達(dá)到21.8 g/L，比對(duì)照(16.8 g/L)增加30.1%；(2)添加0.08μM甲氨喋呤，α-酮戊二酸產(chǎn)量達(dá)到20.5 g/L，比對(duì)照增加22.1%；(3)同時(shí)添加以上兩種抑制劑，α-酮戊二酸脫氫酶活性降低了47%，減

3、少了α-酮戊二酸的進(jìn)一步代謝，使其產(chǎn)量達(dá)到了23.5 g/L，比對(duì)照提高了40.1%；(4)在抑制α-酮戊二酸脫氫酶活性的同時(shí)，增加維生素B1濃度至0.04 mg/L時(shí)，α-酮戊二酸產(chǎn)量達(dá)到最大值為28.4 g/L，比對(duì)照增加69.6%，繼續(xù)增加維生素B1濃度，丙酮酸和α-酮戊二酸產(chǎn)量均下降。
　　 2.利用酶切連接技術(shù)，在體外成功構(gòu)建了敲除組件Kgd1::Kan，將該組件轉(zhuǎn)化光滑球擬酵母，篩選得到α-酮戊二酸脫氫酶系-El基因

4、kgdl缺陷的工程菌T.glabratakgd1::kan。相對(duì)于出發(fā)菌株，對(duì)工程菌研究結(jié)果表明:(1)在α-酮戊二酸脫氫酶途徑受阻的情況下，細(xì)胞選擇了增加乙醛酸途徑流量來(lái)完成碳源的代謝，形成了TCA-乙醛酸循環(huán)；(2)α-酮戊二酸脫氫酶活性缺失，導(dǎo)致胞內(nèi)NADH/NAD水平下降了33.7%，ATP/ADP水平下降了31.8%，而與NADH代謝相關(guān)的丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的活性分別提高了58.1%、33.3%和32.

5、5%，導(dǎo)致胞內(nèi)丙酮酸含量下降了50.1%，琥珀酸、蘋(píng)果酸和α-酮戊二酸的胞內(nèi)含量分別增加了172.7%、66.1%和41.1%，TCA-乙醛酸循環(huán)通量增加；(3)丙酮酸族氨基酸含量下降了29.3%，而胞內(nèi)谷氨酸族氨基酸和天冬氨酸族氨基酸含量分別提高了34.7%和26.8%。以上結(jié)論說(shuō)明，α-酮戊二酸脫氫酶系在細(xì)胞能量代謝、碳源代謝和氨基酸代謝中均起到了不可忽視的調(diào)節(jié)作用。
　　 3.對(duì)重組菌T.glabrata kgdl::ka

6、n的發(fā)酵特性研究發(fā)現(xiàn)，在α-酮戊二酸脫氫酶活性缺失的同時(shí)增加培養(yǎng)基中維生素B1濃度提高丙酮酸脫氫酶活性，α-酮戊二酸產(chǎn)量達(dá)到22.0 g/L，同時(shí)CKG/CPYR值達(dá)到1.14，比出發(fā)菌正常發(fā)酵條件下分別提高了33.4%和1.11倍。然而，相比相同維生素條件下α-酮戊二酸脫氫酶受部分抑制的情況，卻降低了22.6%和30.7%。α-酮戊二酸脫氫酶活性的完全缺失導(dǎo)致原本流量較小的乙醛酸循環(huán)成為碳主流代謝途徑，從而繞過(guò)α-酮戊二酸這一節(jié)點(diǎn)完成

7、細(xì)胞代謝，導(dǎo)致碳源流失。因此，對(duì)于碳代謝流的調(diào)控，α-酮戊二酸脫氫酶途徑的部分抑制比完全阻斷更有利于α-酮戊二酸的積累。
　　 4.利用酶切連接技術(shù)，在體外成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pYX-PDA1，將其轉(zhuǎn)化T.glabrata△ura3感受態(tài)細(xì)胞，成功地篩選得到了一株過(guò)量表達(dá)丙酮酸脫氫酶的光滑球擬酵母T.glabrata-pdal。重組菌胞內(nèi)丙酮酸脫氫酶表達(dá)活性達(dá)到0.35 U/mg protein，為出發(fā)菌的3.8倍。比較重組菌與出