光滑球擬酵母中糖酵解效率與丙酮酸合成的調(diào)控研究.pdf

1、本文以一株能在胞外大量積累丙酮酸的光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)四重維生素(硫胺素、生物素、吡哆醇和煙酸)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株CCTCCM202019為研究菌株。以丙酮酸高效生產(chǎn)為目標(biāo)，在充分了解光滑球擬酵母中能量和碳代謝途徑的基礎(chǔ)上利用生物化學(xué)和菌種選育的理論和方法，就調(diào)控糖酵解效率和丙酮酸合成的關(guān)鍵因素及其作用機(jī)理開展研究。主要研究結(jié)果如下： 1.利用氧化磷酸化抑制劑(魚藤酮、抗霉素A和寡霉素)和菌種誘變從

2、內(nèi)外源兩個(gè)方面研究降低胞內(nèi)能荷水平對(duì)酵解途徑的影響及調(diào)控機(jī)理。添加外源抑制劑顯著降低了胞內(nèi)ATP水平，提高了糖酵解關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶(PFK)活性，進(jìn)而提高T.glabrata葡萄糖消耗速度和丙酮酸生產(chǎn)速度。改變胞內(nèi)ATP水平并不影響糖酵解途徑其他關(guān)鍵酶己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)活性。在氧化磷酸化途徑中，F(xiàn)0F1-ATPase在ATP合成中起著關(guān)鍵性的作用。利用菌種選育技術(shù)獲得F0F1-ATPase活性降低65％的突變株N07

3、。添加F0F1-ATPase抑制劑雙環(huán)己基碳二亞胺(DCCD)、疊氮鈉(NaN3)、新霉素并不降低突變株N07的F0F1-ATPase活性。F0F1-ATPase活性的降低提高了底物水平磷酸化途徑(酵解途徑)關(guān)鍵酶的活性。與出發(fā)菌株比較，N07菌的葡萄糖消耗速度和丙酮酸生產(chǎn)速度分別提高了34％和42.9％，發(fā)酵周期縮短12h； 2.綜合外源抑制劑和內(nèi)源突變對(duì)T.glabrata能量代謝和酵解的影響，發(fā)現(xiàn)：降低胞內(nèi)ATP含量能顯著

4、提高PFK活性(R2=0.9971)和葡萄糖消耗速度(R2=0.9967)以及丙酮酸生產(chǎn)速度(R2=0.965)，葡萄糖消耗速度的增加是糖酵解途徑中關(guān)鍵酶PFK活性(R2=0.9958)和PK活性(R2=0.8706)增加所導(dǎo)致的。這一結(jié)果從能量代謝流、碳代謝流和關(guān)鍵酶活性等三方面揭示了真核微生物細(xì)胞中氧化磷酸化途徑與中心代謝途徑(酵解)的定量關(guān)系； 3利用高溶氧條件下阻斷電子傳遞鏈和低溶氧下提高乙醇脫氫酶活性的方法，研究改變T

5、.glabrata中NADH氧化途徑對(duì)能量代謝和酵解途徑的影響。在搖瓶中增加培養(yǎng)基中NAD+前體物質(zhì)--煙酸(NA)的濃度促進(jìn)了葡萄糖消耗速度(2.01g/(L·h)和丙酮酸產(chǎn)量(46.4g/L)的提高。T.glabrataCCTCCM202019經(jīng)溴化乙錠(EtBr)處理后獲得F0F1-ATPase、復(fù)合體Ⅰ、復(fù)合體Ⅰ+Ⅲ、復(fù)合體Ⅱ+Ⅲ、復(fù)合體Ⅳ活性下降22.2％、41.6％、53.1％、23.6％和84.7％的呼吸缺陷型突變株RD-

6、18，在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期流加2.1mmol/L外源電子受體乙醛使呼吸缺陷型突變株RD-18單位細(xì)胞消耗葡萄糖和生產(chǎn)丙酮酸的能力分別提高了15.4％和23.4％、丙酮酸產(chǎn)量提高14.3％、葡萄糖消耗速度提高17.6％。外源電子受體乙醛的添加提高了磷酸果糖激酶活性，降低了胞內(nèi)NADH濃度和NADH/NAD+比率； 4為了提高低溶氧條件下胞內(nèi)NAD+含量，T.glabrataCCTCCM202019經(jīng)亞硝基胍誘變處理后獲得能以乙醇為唯一

7、碳源生長(zhǎng)且乙醇脫氫酶(ADH)活性提高110％的突變株WSH-13。低溶氧條件下(DO=20％)，在突變株WSH-13培養(yǎng)體系中添加并將外源電子受體乙醛濃度維持在4mg/L，使得葡萄糖消耗速度、丙酮酸生產(chǎn)速度、丙酮酸產(chǎn)率和丙酮酸濃度分別提高了16.2％、68％、44％和45％，而胞內(nèi)ATP水平和NADH/NAD+比率則分別下降了12.6％和63.9％。這一結(jié)果表明，通過(guò)阻斷電子傳遞鏈或降低溶氧水平能有效地抑制NADH通過(guò)氧化磷酸化途徑氧

8、化且能顯著降低胞內(nèi)ATP水平，在添加外源電子受體乙醛的條件下，將NADH氧化途徑從產(chǎn)生大量ATP的氧化磷酸化途徑轉(zhuǎn)向無(wú)ATP產(chǎn)生的乙醇發(fā)酵途徑，從而加速了葡萄糖代謝和提高丙酮酸的生產(chǎn)強(qiáng)度； 5.通過(guò)添加己糖激酶抑制劑CibacronBlue3G-A降低T.glabrata己糖激酶(HK)活性使得葡萄糖消耗速度下降，表明由HK所催化的葡萄糖磷酸化過(guò)程在糖酵解中起著關(guān)鍵作用。Mg2+需與胞內(nèi)ATP形成Mg-ATP復(fù)合物才能激活HK活

9、性。將菌株CCTCCM202019和N07經(jīng)NTG誘變處理后獲得HK活性均提高45％左右的突變株DGR09和DN11。盡管突變株DGR09中HK活性提高45％，葡萄糖磷酸化能力提高45.3％，胞內(nèi)葡萄糖含量降低42.4％，但并不能提高葡萄糖消耗速度。而突變株DN11中己糖激酶活性同樣提高45.3％，但葡萄糖消耗速度提高了16.2％(菌株N07)、51.9％(菌株CCTCCM202019)和49.4％(菌株DGR09)。這一結(jié)果表明，在降

10、低細(xì)胞能荷水平的基礎(chǔ)上提高HK活性和葡萄糖磷酸化能力促進(jìn)了T.glabrata葡萄糖消耗速度的提高； 6.T.glabrata菌體生長(zhǎng)和丙酮酸生產(chǎn)能力隨著培養(yǎng)基中氯化鈉或山梨醇濃度的增加而降低。利用pH控制的連續(xù)培養(yǎng)方法，以高濃度氯化鈉為選擇性壓力，獲得了一株能耐受70g/L氯化鈉或0.6mol/L山梨醇的突變株RS23。突變株在含有150g/L葡萄糖培養(yǎng)基中，發(fā)酵82h時(shí)葡萄糖消耗完畢，此時(shí)丙酮酸濃度為94.3g/L，丙酮酸的

11、產(chǎn)率為0.635g/g。比出發(fā)菌株分別提高了41.1％和11.1％。這一結(jié)果表明，提高T.glabrata耐受高濃度氯化鈉的能力促進(jìn)了丙酮酸的生產(chǎn)，為如何解決工業(yè)發(fā)酵普遍存在的產(chǎn)物抑制提供了新的策略； 7.以解除了酵解抑制的突變株DN11和解除了產(chǎn)物抑制的突變株RS23為親本菌株，經(jīng)三輪genomeshuffling操作獲得了最佳重組子F3-28。7-L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)證實(shí)F3-28丙酮酸產(chǎn)量比CCTCCM202019、RS23和DN