芽孢桿菌產(chǎn)丁二酮的代謝調(diào)控及發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、丁二酮具有強(qiáng)烈奶油香味，廣泛應(yīng)用于在奶油、酒類等食品、化妝品及煙草工業(yè)中。微生物法生產(chǎn)丁二酮是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但丁二酮的產(chǎn)量很低，目前的首要研究目標(biāo)是提高丁二酮的產(chǎn)量。芽孢桿菌是一種食品安全菌株，其丁二酮的代謝生成途徑是以葡萄糖為底物經(jīng)糖酵解轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸經(jīng)α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactate synthase，ALS)催化生成(S)-α-乙酰乳酸，隨后經(jīng)非酶氧化脫羧生成丁二酮;丁二酮可被meso-2，3-丁二醇脫氫

2、酶(meso-2，3-butanediol dehydrogenase，BDH)還原生成(S)-乙偶姻，最后被還原為(2S,3S)-或meso-2，3-丁二醇;同時(shí)，(S)-α-乙酰乳酸也可經(jīng)α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolactatedecarboxylase，ALDC)直接脫羧產(chǎn)生(R）-乙偶姻，經(jīng)BDH還原為(2R，3R)-或meso-2，3-丁二醇。即乙偶姻和2，3-丁二醇是丁二酮的競(jìng)爭(zhēng)性副產(chǎn)物，其與丁二酮共用一個(gè)前體物α-

3、乙酰乳酸。本課題以一株高產(chǎn)乙偶姻的芽孢桿菌(Bacillus subspeciesDL01，B.sp.DL01)為出發(fā)菌株，研究丁二酮代謝途徑中關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、代謝調(diào)控機(jī)制;同時(shí)，運(yùn)用代謝工程技術(shù)，對(duì)該菌株丁二酮合成代謝途徑進(jìn)行改造，獲得高效的丁二酮生產(chǎn)菌株，結(jié)合發(fā)酵過程優(yōu)化等代謝控制發(fā)酵技術(shù)，實(shí)現(xiàn)丁二酮的綠色制造，具體如下:
　　1.丁二酮代謝關(guān)鍵酶BDH的表征
　　克隆了B.sp.DL01的BDH基因budC，與

4、來源于E.aerogenes CICC10293的budC比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩處堿基不同g.27A/T和g.581A/G，其中g(shù).581A/G導(dǎo)致一個(gè)氨基酸發(fā)生突變p.D194G。將兩種不同來源的budC在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)，純化后得到BDH，分別標(biāo)記為D194G-BDH和BDH。采用分子排阻色譜法和MALDI-TOF MS確定其分子量，得出D194G-BDH和BDH都是同源四聚體蛋白。分析D194G-BDH和BDH的酶學(xué)性

5、質(zhì)及酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)D194G-BDH的活性僅為BDH的2.3％，并且喪失了氧化meso-2，3-丁二醇的能力以及利用NADPH輔酶的能力。二者均以乙偶姻/NADH為最適底物，D194G-BDH的Km是BDH的5.63倍。圓二色光譜和native-PAGE分析發(fā)現(xiàn)D194G-BDH和BDH具有相似的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，均以同源四聚體形式存在。用胰蛋白酶消化兩種酶蛋白，發(fā)現(xiàn)D194G-BDH對(duì)胰蛋白酶十分敏感，表明D194G導(dǎo)致D194

6、G-BDH的構(gòu)象發(fā)生改變，從而活性減弱。選擇Klebsiella pneumoniae-BDH的X射線晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:1GEG)為模板，通過同源建模建立D194G-BDH和BDH與底物乙偶姻和輔酶NADH的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Asp194不在BDH的催化四聯(lián)體(Asn-Ser-Tyr-Lys)附近，Gly的短側(cè)鏈和非極性破壞了Asp194與Gly206，Gly208和Thr209的氮原子之間的氫鍵和靜電相互作用。在B.sp.DL0

7、1中重組表達(dá)來源于產(chǎn)氣桿菌的有活性的BDH，發(fā)現(xiàn)B.sp.DL01產(chǎn)生了2，3-丁二醇。通過以上實(shí)驗(yàn)確定了BDH的第194位非保守氨基酸Asp被Gly取代是導(dǎo)致D194G-BDH酶活性損失的原因，造成B.sp.DL01高產(chǎn)乙偶姻，不產(chǎn)2，3-丁二醇。
　　2.B.sp.DL01丁二酮合成途徑代謝流的調(diào)控
　　采用同源重組敲除ALDC編碼基因alsD，構(gòu)建ALDC敲除菌株B.sp.DL01-△alsD，其ALDC沒有活性，積累

8、了0.41 g/L丁二酮。向敲除菌株中導(dǎo)入表達(dá)ALS基因alsS的重組質(zhì)粒pHY300PLK-alsS，構(gòu)建了敲除ALDC并過表達(dá)ALS的基因工程菌B.sp.DL01-△alsD-alsS，其ALS活性(0.68 U/mg)提高了2.5倍，α-乙酰乳酸的產(chǎn)量由0.58 g/L提高到1.19 g/L，增加了2.1倍，積累了0.53 g/L丁二酮，是B.sp.DL01-△alsD的1.3倍。為促進(jìn)α-乙酰乳酸非酶氧化生成丁二酮，在發(fā)酵培養(yǎng)1

9、2h后，向培養(yǎng)基中添加20 mMFe3+，丁二酮產(chǎn)量由0.53 g/L增加到1.22 g/L，提高了2.3倍。
　　3.優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件提高丁二酮的產(chǎn)量
　　通過搖瓶發(fā)酵，優(yōu)化了B.sp.DL01-△alsD-alsS發(fā)酵過程的控制參數(shù)和發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)B.sp.DL01-△alsD-alsS，在發(fā)酵12h后添加20 mM Fe3+，經(jīng)72 h發(fā)酵，丁二酮產(chǎn)量達(dá)3.98 g/L。丁二酮的沸點(diǎn)較低，為88℃，采用水回收從

10、發(fā)酵罐中揮發(fā)的丁二酮。5L發(fā)酵罐，發(fā)酵過程中未調(diào)控pH（發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6.6）與控制pH為6.6相比，丁二酮產(chǎn)量和發(fā)酵效率無明顯變化。溶氧對(duì)丁二酮產(chǎn)量和發(fā)酵效率影響較明顯，通氣量為0.6 vvm和攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)的溶氧水平更有利于丁二酮的生成。采用恒底物補(bǔ)料發(fā)酵，維持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在10 g/L左右，發(fā)酵至48 h，共消耗葡萄糖58 g/L，丁二酮產(chǎn)量達(dá)8.69 g/L，產(chǎn)率達(dá)0.15 g/g葡萄糖，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)0