酵母在不同培養(yǎng)環(huán)境下中間代謝途徑代謝調(diào)控過程的研究.pdf

1、隨著酵母完整的基因測序已經(jīng)基本完成，人類第一次獲得了真核細胞生物基因組的完整核苷酸序列，酵母基本的代謝過程也已經(jīng)了解。同時酵母又是一種重要的工業(yè)微生物，也是代謝工程的基礎研究中一種較好的模式生物。但對于其在不同條件、不同的環(huán)境及生長的不同階段等情況下胞內(nèi)產(chǎn)生的系統(tǒng)而精細的代謝過程的調(diào)控還不是十分清楚，這些方面的研究一直以來就是基礎理論與生產(chǎn)實踐中的熱點問題。本文通過發(fā)酵過程生長參數(shù)的分析、酶活性檢測、蛋白質(zhì)組分析和代謝通量分析研究了S.

2、cerevisiae利用不同的碳源和不同生長階段時，胞內(nèi)代謝體系的響應及細胞自身的這種代謝調(diào)控的機理。 考察了酵母中間代謝途徑中一些關(guān)鍵酶活性，包括糖酵解途徑(丙酮酸激酶，pyk)，磷酸戊糖途徑(6-磷酸葡萄糖脫氫酶，G6PDH)，三羧酸循環(huán)(異檸檬酸脫氫酶，ICDH；α-酮戊二酸脫氫酶，2-KGDH)，和糖異生途徑(FBPase)以及磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(pck)。采用固相pH梯度-SDS聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳對釀酒酵母S

3、.cerevisiae利用不同碳源和培養(yǎng)的不同階段時細胞的總蛋白進行分離，使用2D蛋白質(zhì)圖像分析系統(tǒng)Imagemaster2DElite對雙向電泳圖譜進行定量分析。以MIPS酵母代謝數(shù)據(jù)庫為基礎，建立了包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)、一些回補反應、發(fā)酵途徑的中間代謝途徑和氨基酸生物合成途徑等的代謝模型，并根據(jù)反應機理，以原子映射矩陣對其反應中的碳原子去向進行描述。對于同種物質(zhì)相互之間進行的雙分子反應，對其原子映射矩陣進行拆分處

4、理，對稱分子生成非對稱分子的反應，則需按兩條反應路線計算。通過同模式標記分子向量和原子映射矩陣來構(gòu)造同位素映射矩陣。在中間代謝產(chǎn)物平衡的基礎上，以分布向量、同位素映射矩陣和反應映射矩陣等建立了同位素分布平衡的非線性限制條件系統(tǒng)。相對于傳統(tǒng)的代謝通量分析方法，不考慮不確定性大的輔酶因子NADH、NADPH和ADP、ATP等的平衡關(guān)系，以同位素平衡的限制條件來代替以往的最大化比生長速率、最大化生物量、最小化能量需求、能量平衡等限制條件。對該

5、同位素平衡非線性系統(tǒng)的Jacobi矩陣偏微分解析形式做一些理論探討。采用K.Schmidt等學者提出的均值迭代法(iterativeaveraging)來計算同位素的穩(wěn)態(tài)分布。以胞外代謝產(chǎn)物的測量值、氨基酸13C標記模式分布信息與計算值之間的偏差作為初始適應度函數(shù)，對其進行線性定標，根據(jù)個體的適應度函數(shù)值所度量的優(yōu)、劣程度決定它所攜帶的自由通量信息在下一代是被淘汰還是被遺傳。結(jié)果表明，適應度較大(優(yōu)良)個體有較大的存在機會，而適應度較小

6、(低劣)的個體繼續(xù)存在的機會也較小。以自然選擇和群體遺傳理論為基礎，模擬生物進化過程中適者生存規(guī)則和群體內(nèi)部染色體的信息隨機交換機制，并輔以SSP作為局部優(yōu)化方法，雜合基因算法被整合在代謝通量分析中。 實驗結(jié)果表明：在葡萄糖作碳源的對數(shù)期時，為了有效地利用葡萄糖，葡萄糖激酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶表現(xiàn)了較高的表達量，相應地在葡萄糖消耗完的后期和乳酸作碳源時上述兩種酶的表達量較低或未被檢測到。磷酸甘油酸激酶、烯醇酶和丙酮酸激酶也都在以葡

7、萄糖為碳源時顯示了較高的表達量，此時丙酮酸激酶的酶活性也比葡萄糖消耗光的后期和乳酸作為碳源的情況高很多，表明在利用葡萄糖為碳源時相對于利用乙醇和乳酸時，糖酵解途徑要更活躍。這種趨勢在磷酸戊糖途徑的氧化階段尤為明顯。而作為DNA、RNA、色氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸等生物合成前體的4-磷酸赤蘚糖和5-磷酸核糖主要由磷酸戊糖途徑的非氧化階段來提供。對乙醇的利用主要通過乙醛酸支路，生成的蘋果酸進而在蘋果酸酶的作用下回補到丙酮酸，彌補了由于糖酵解

8、途徑的削弱而帶來的作為賴氨酸、異亮氨酸等前體的丙酮酸的損失。該結(jié)果與Cortassa等人的發(fā)現(xiàn)一致。而由于蘋果酸酶也包含NADP依賴的異構(gòu)體，所以也構(gòu)成了對削弱的磷酸戊糖途徑氧化階段(zwf)所帶來的NADPH損失的一種補償機制。磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(pck)在吸收利用乙醇和乳酸時比利用葡萄糖作碳源時表現(xiàn)了較高的表達量，酶的活性比葡萄糖作為碳源時高3倍和6倍左右。說明乙醇被轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，乳酸被轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進而被轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A

9、，分別進入三羧酸循環(huán)以后，磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶催化的從草酰乙酸到磷酸烯醇式丙酮酸的回補反應在這里起到了重要的糖異生的作用，與H.C.Lange的研究結(jié)果相符。 酶存在的量是它的合成和降解速率之間的一種平衡，酶活性檢測和蛋白質(zhì)組雙向電泳解析表明二者基本上成正相關(guān)。這是由于胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度的水平受到其合成和降解速率的影響，同時mRNA的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移出細胞核、在細胞質(zhì)內(nèi)的降解以及在核糖體上的翻譯都直接控制著酶的表達量，尤其是mRNA轉(zhuǎn)

10、錄的速率受到嚴格的控制。 在葡萄糖和甘油作為碳源時，菌體生物量得率幾乎相同，而在乙酸作為碳源時生物量得率相對較低，同時CO2生成速率和O2攝入速率較高，表明在這種條件下呼吸作用可能較為旺盛，在代謝通量的分析進一步印證了這種現(xiàn)象。因為S.cerevisiae合成細胞壁的需要，作為多糖合成的前體，6-磷酸葡萄糖成為中間代謝途徑內(nèi)最大的輸出源。在葡萄糖和甘油作為碳源培養(yǎng)時，相對于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶所催化的回補反應，丙酮酸羧化酶所催

11、化的從丙酮酸到草酰乙酸的反應在這種條件下為主要的回補反應。 當甘油作為碳源時，糖酵解途徑中的6-磷酸葡萄糖和3-磷酸甘油酸之間的反應的反應方向與葡萄糖作為碳源時的情況相反，起到了糖異生的作用。而作為組氨酸、色氨酸和核苷酸的生物合成前體的5-磷酸核糖仍由磷酸戊糖途徑中的氧化途徑提供。在乙酸作為碳源時從乙酰輔酶A中流出的中間代謝途徑的代謝通量比較明顯地大于葡萄糖和甘油作為碳源的情況，這可能是由于在這種條件下，更多的從乙酰輔酶A合成脂

12、肪的需要，同時在利用乙酸作為碳骨架的來源時從乙酸到乙酰輔酶A的代謝路徑最短。TCA循環(huán)在這種情況下非常活躍，這也與發(fā)酵中的生長相關(guān)參數(shù)和酶活性分析的結(jié)果一致。在利用乙酸作為碳源時，磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶所催化的從草酰乙酸到磷酸烯醇式丙酮酸的反應有很大的通量，起到了重要的糖異生的作用。蘋果酸酶所催化的反應在這種情況下比較活躍，補償了由于比較低的丙酮酸激酶活性而導致的丙酮酸的損失。 在葡萄糖和甘油作為碳源培養(yǎng)時，三羧酸循環(huán)和呼吸途

13、徑?jīng)]有提供足夠的NADPH，所以磷酸戊糖途徑的氧化階段比較活躍，成為這種情況下生物合成所需的NADPH的主要來源，同時作為DNA、RNA、色氨酸、組氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸等的生物合成前體的5-磷酸核糖和4-磷酸赤蘚糖主要由磷酸戊糖途徑中的氧化階段來提供，而在乙酸作為碳源的情況下5-磷酸核糖和4-磷酸赤蘚糖主要由磷酸戊糖途徑中的非氧化途徑來提供，作為一種補償機制，三羧酸循環(huán)比較活躍，NADPH在這種情況下主要來源于三羧酸循環(huán)。

14、在甘油作為碳源培養(yǎng)時磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的活性比以葡萄糖為碳源時的情況稍高，與代謝通量分析的結(jié)果一致。與葡萄糖作為碳源的情況相比，在甘油和乙酸作為碳源時，該糖異生反應通量的增大消耗了由于氧氣攝入速率和二氧化碳生成速率的增大而產(chǎn)生的更多的ATP，起到了均衡調(diào)控代謝過程的冗余循環(huán)(futilecycle)的作用。二磷酸果糖酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶所催化的反應路線在利用甘油和乙酸作為碳源時成為糖異生的主要途徑，提供了可以被磷酸戊糖途徑的非氧化