谷氨酸棒桿菌無(wú)痕基因修飾系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、谷氨酸棒桿菌是工業(yè)生產(chǎn)氨基酸的重要菌株，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及飼料等行業(yè)。其生長(zhǎng)快速，適應(yīng)性好，具有作為新型細(xì)胞工廠的潛力，有著廣闊的應(yīng)用前景。然而相比大腸桿菌，釀酒酵母等模式生物，其基因修飾技術(shù)相對(duì)滯后。本研究首先針對(duì)目前基因修飾系統(tǒng)中轉(zhuǎn)化子假陽(yáng)性率高的問題，引入新的有效負(fù)篩選標(biāo)記，并結(jié)合雙鏈斷裂重組技術(shù)，構(gòu)建基因無(wú)痕修飾的雙交換重組系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上，借助大腸桿菌重組酶，實(shí)現(xiàn)了雙鏈PCR片段對(duì)基因組的無(wú)痕修飾。
　　在谷氨酸棒桿

2、菌中，主要采用質(zhì)粒pK18mobsacB進(jìn)行基因的修飾，但是sacB作為負(fù)篩選標(biāo)記基因存在假陽(yáng)性高的問題。本研究中首先通過比較谷氨酸棒桿菌野生型菌株（WT）與upp基因敲除型（WT-Δupp）菌株對(duì)致死物質(zhì)5-氟尿嘧啶（5-FU）的耐受性，驗(yàn)證了upp基因作為負(fù)篩選標(biāo)記的可行性。在相同Ptrc啟動(dòng)子調(diào)控下，upp較sacB有較低的假陽(yáng)性率，降低了約10倍。證明了其更適合作為谷氨酸棒桿菌基因操作系統(tǒng)中的負(fù)篩選標(biāo)記。并進(jìn)一步確定了upp作為

3、負(fù)篩選標(biāo)記時(shí)，致死物5-FU的最佳篩選濃度為100μM。
　　通過構(gòu)建含有upp負(fù)篩選盒子的通用質(zhì)粒載體pCupp，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)I-SceI核酸內(nèi)切酶的輔助質(zhì)粒pEC-XK99E-SceI-recET，進(jìn)一步將upp負(fù)篩選標(biāo)記與I-SceI核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的雙鏈斷裂重組技術(shù)相結(jié)合，組建雙交換重組系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因ldhA的敲除。I-SceI核酸內(nèi)切酶的表達(dá)對(duì)負(fù)篩選盒子彈出效率具有重要影響，最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度為1.5 m