好氧條件下高效產(chǎn)琥珀酸谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建.pdf

1、琥珀酸是一種重要的四碳平臺化合物,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及食品等領(lǐng)域。微生物法發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸以其社會、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益展現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum作為傳統(tǒng)的氨基酸生產(chǎn)菌,是工業(yè)生物技術(shù)中各種化學(xué)品的生產(chǎn)平臺菌株。相比厭氧發(fā)酵受還原力NADH不足的限制,好氧發(fā)酵中高密度的生物量積累、高的碳通量以及快速的產(chǎn)物生成等優(yōu)點(diǎn)使其更有利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
　　敲除琥珀酸脫氫酶系的谷氨

2、酸棒桿菌能夠在好氧條件下生產(chǎn)琥珀酸,乙酸是主要的副產(chǎn)物。敲除所有已知的乙酸生成途徑,同時過表達(dá)回補(bǔ)途徑的相關(guān)酶,發(fā)現(xiàn)仍有乙酸積累。構(gòu)建乙酸利用途徑能夠解決這一問題,即將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中編碼乙酰輔酶A合成酶的基因acs和acsA分別引入到好氧生產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌中,經(jīng)發(fā)酵比較發(fā)現(xiàn)二者均能完全消除乙酸積累,而acsA的引入即菌株ZX1(pEacsA)有更高的琥珀酸產(chǎn)量,得率為0.50mol(molglucose)-1。然而,這一

3、操作導(dǎo)致丙酮酸積累增加,為了增加琥珀酸生產(chǎn)的碳通量,過表達(dá)谷氨酸棒桿菌自身的編碼檸檬酸合成酶的基因gltA,得到菌株ZX1(pEacsAgltA)。相比菌株ZX1(pEacsA),菌株ZX1(pEacsAgltA)的琥珀酸得率提高22％,丙酮酸得率下降62%。分批補(bǔ)料發(fā)酵菌株ZX1(pEacsAgltA),最終生產(chǎn)241mM琥珀酸,平均體積產(chǎn)率為3.55mMh-1,得率為0.63mol(molglucose)-1。由此,本文為好氧生產(chǎn)琥

4、珀酸的大規(guī)模工業(yè)化提供了一個有潛力的平臺。
　　農(nóng)業(yè)廢棄物中的阿拉伯糖,被公認(rèn)為是微生物發(fā)酵生產(chǎn)高價值化學(xué)品的理想原料之一。這里將大腸桿菌的阿拉伯糖操縱子araBAD引入到生產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌中,使其能夠在好氧條件下利用L-阿拉伯糖為單一碳源生產(chǎn)琥珀酸。另外,為了增加流向琥珀酸的碳通量,共表達(dá)谷氨酸棒桿菌自身的檸檬酸合成酶和來自枯草芽孢桿菌的乙酰輔酶A合成酶,得到的菌株ZX1(pXaraBAD,pEacsAgltA)生產(chǎn)了82