發(fā)酵型蜂蜜桑椹酒的釀造技術(shù)及品質(zhì)特征研究.pdf

1、桑椹為桑（Morus alba Linn．）的成熟果穗，是國家衛(wèi)生部1988年首批公布的醫(yī)食同源植物品種之一，我國桑椹產(chǎn)量位居世界首位。桑椹屬于熱性漿果，極不耐貯，易腐爛、變質(zhì)。桑椹富含糖、酸、維生素、礦物元素，還含有花色苷、酚酸和黃酮等多種活性物質(zhì)。本文將天然蜂蜜與桑椹結(jié)合，釀制營養(yǎng)全面的復(fù)合型果酒，不僅符合了酒類行業(yè)的發(fā)展趨勢，而且還將打造出綠色的保健果酒品牌，迎合當今消費及市場需求。目前，我國幾乎沒有蜂蜜桑椹酒的釀造技術(shù)和品質(zhì)特征

2、方面的系統(tǒng)性研究。 本論文以蜂蜜和桑椹為主要原料，應(yīng)用傳統(tǒng)的微生物分離技術(shù)，結(jié)合生物技術(shù)和儀器分析技術(shù)，采用理化指標分析結(jié)合感官評定技術(shù)，對桑椹和桑園土壤中優(yōu)良酵母菌的分離、篩選和鑒定，蜂蜜桑椹酒釀造酵母菌株的構(gòu)建，蜂蜜桑椹酒的發(fā)酵工藝及澄清條件，蜂蜜桑椹酒的基本化學成分和香氣成分分析等方面進行了系統(tǒng)深入的研究。在蜂蜜桑椹酒的專用菌株、發(fā)酵工藝及品質(zhì)特征等方面取得了較大的研究進展。主要研究結(jié)果為： 1、從成熟桑椹和桑園土

3、壤的富集培養(yǎng)液，以及蜂蜜桑椹汁的自然發(fā)酵液中，共分離得到112株酵母菌。經(jīng)逐級篩選，優(yōu)選出兩株酵母菌，命名為HM和SM。HM分別在酒精濃度16%，SO2濃度250 mg/L，pH2．01時，1d內(nèi)產(chǎn)氣；SM在酒精濃度14%時，1．5d內(nèi)產(chǎn)氣，在SO2濃度200 mg/L時，1d內(nèi)產(chǎn)氣，在pH1．50時，2d內(nèi)產(chǎn)氣。HM和SM發(fā)酵蜂蜜桑椹汁，酒精度分別為9．7%，7．0%（V/V），總酯產(chǎn)量分別為1890．5，2143．8（mg/L），感

4、官綜合得分分別為84．9，83．1（分），發(fā)酵酒具有素雅的桑果香和怡人的酒香，典型性突出。鑒定結(jié)果表明，酵母菌HM為酵母屬的釀滔酵母（Saccharomyces cerevisive），酵母菌SM為有孢圓酵母屬的德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）。 2、對原生質(zhì)體融合的各種技術(shù)條件進行了系統(tǒng)研究，結(jié)論如下： （1）確定以Y1（n）（單倍體Y1（a12））和HM（n）（單倍體HM（a4））為

5、原生質(zhì)體融合的兩個親本菌株。確定含2．0mg/mLCuSO4的完全培養(yǎng)基為選擇性培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上，Y1（n）能生長而HM（n）不能生長。 （2）原生質(zhì)體形成和再生條件：將Y1（n）在YEPD中培養(yǎng)4h（28℃和180r/min）后，用含0．1%β-巰基乙醇的預(yù)處理劑處理10min（30℃和180r/min），再用含1．0%蝸牛酶的酶解液處理1．0h（30℃和120r/min），原生質(zhì)體形成率達到94．2%，再生率達到27．1

6、%；將HM（n）在YEPD中培養(yǎng)5h（28℃和180r/min）后，用含0．1%β-巰基乙醇的預(yù)處理劑處理10min（30℃和180r/min），再用含1．5%蝸牛酶的酶解液處理1．5h（30℃和120r/min），原生質(zhì)體形成率達到95．4%，再生率達到22．2%。在原生質(zhì)體形成時用0．7mol/LKCI來配制酶解溶液，而在原生質(zhì)體再生時，用17%蔗糖來配制稀釋液和高滲再生培養(yǎng)基。 （3）Y1（n）原生質(zhì)體滅活條件：60℃恒溫

7、水浴處理20min，滅活率達到100%。 （4）兩親本菌株按1：1比例混合（濃度均為1×107個/mL），于30℃和180r/min條件下培養(yǎng)15min，加入促融劑溶液，振蕩10 nun，再靜止10 min，融合率達到4．85×10-6。 （5）篩選及鑒定：通過TTC顯色法和杜氏管發(fā)酵法初步篩選出10株發(fā)酵能力較強的融合子；通過釀造酒復(fù)篩試驗，結(jié)合模糊綜合評判法優(yōu)選出F6和F10兩株融合子，以F6最佳。細胞的形態(tài)、大小、

8、DNA含量和抗藥性分析結(jié)果表明，融合子F6和F10為兩親本菌株真正的融合子。 （6）遺傳穩(wěn)定性檢驗：融合子F6和F10經(jīng)連續(xù)傳代20次后，其主要性能仍然很穩(wěn)定，沒有發(fā)生同復(fù)突變現(xiàn)象，說明兩融合子具有遺傳穩(wěn)定性。 （7）通過基本生理特性和發(fā)酵性能比較，揭示了融合子和親本之間的相互關(guān)系。 3、融合子F6的發(fā)酵工藝條件包括：桑椹最佳果膠酶酶解條件為酶解溫度35℃，酶用量為每kg桑椹漿添加0．4mL諾維信酸性果膠酶BEC

9、，酶解時間100min，自流汁得率為14．826%。初始糖度以24%（還原糖220 g/L左右）為宜。采用濁汁發(fā)酵，在后期通過下膠對原酒進行澄清處理。研究了發(fā)酵溫度、接種量、初始pH值、SO2添加量和裝液量五個因素影響主發(fā)酵過程的具體情況：建立了主發(fā)酵質(zhì)量預(yù)測模型為Y=88．64936-6．19732X1+1．49109X2+2．88565X3－4，08817X12－2．49718X32+1．62500X1X2+1．37500X2X3<

10、X1-發(fā)酵溫度，X2-接種量，X3-初始pH值），優(yōu)化的主發(fā)酵條件為溫度23℃，接種量10%（VN）和pH值3．5。后發(fā)酵溫度選擇10～15℃。澄清試驗結(jié)果表明，以殼聚糖0．6g/L+PVPP1．0g/L復(fù)合的澄清效果最好，透光率達到60．6%，色度值為12．8，澄清處理后的酒樣在酒度、糖含量和酸含量上沒有變化，酚類物質(zhì)和蛋白質(zhì)被澄清劑絮凝去除而減少，提高了蜂蜜桑椹酒的穩(wěn)定性。 4、分別以大十桑椹、紅果2號桑椹和紅果1號桑椹和農(nóng)

11、用桑椹為原料，發(fā)酵得到四種蜂蜜桑椹酒，分析了它們含有的各種成分。四種酒樣在總糖、總酸、pH值、酒度、揮發(fā)酸和單寧等成分上差異不大，但蛋白質(zhì)含量差異較大。各種礦物元素的含量因品種不同而存在一定差異，但均表現(xiàn)出高鉀低鈉的突出特點，鎂元素含量很高，硒元素含量5．0～8．5μg/L。氨基酸總含量和必需氨基酸含量以紅果1號桑椹蜂蜜發(fā)酵酒最高，而農(nóng)用桑椹蜂蜜發(fā)酵酒最低；必需氨基酸含量占氨基酸總量的比例在四種酒樣間差異不明顯；從氨基酸種類含量來看，四

12、種酒樣在氨基酸組分上的差異顯著（p<0．05）。蜂蜜桑椹酒的總二氧化硫、游離二氧化硫及有害微生物指標的檢測結(jié)果符合國家發(fā)酵酒衛(wèi)生標準。 對蜂蜜桑椹酒中多酚類物質(zhì)的情況進行了較詳細的研究。結(jié)果表明，農(nóng)用桑椹蜂蜜發(fā)酵酒的總酚、總黃酮和總花色苷含量最高，而紅果1號桑椹蜂蜜發(fā)酵酒最低，大十桑椹和紅果2號桑椹蜂蜜發(fā)酵酒居中。進一步對酒樣中7種酚酸和5種黃酮醇進行了分析，建立了高效液相色譜分析方法，采用Agilent Analytical

13、CI8色譜柱（250mm×4．6mm，5．0μm），酚酸測定方法為：流動相為甲醇-甲酸溶液進行梯度洗脫，流速1．0mL/min，柱溫30℃，檢測波長260nm，進樣量20μL；黃酮醇測定方法為：流動相為甲醇－乙酸溶液進行梯度洗脫，流速1．0mL/min，柱溫30℃，檢測波長360nm，進樣量20μL。測定結(jié)果表明，蜂蜜桑椹酒中原兒茶酸、槲皮素和桑色素的含量很高，這可能是其區(qū)別于其它果酒的重要特征：各種酚酸和黃酮醇類物質(zhì)在不同酒種之間存在

14、一定程度的差異，以酚酸中的咖啡酸和黃酮醇中的蘆丁含量差異最大，這兩種物質(zhì)可能是區(qū)別不同酒種的重要依據(jù)。 5、從大十桑椹、紅果2號桑椹、紅果1號桑椹和農(nóng)用桑椹四種果汁中共檢出64種揮發(fā)性成分，主要成分包括亞油酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、油酸、亞油酸乙酯、亞油酸甲酯、亞麻酸乙酯、油酸甲酯、3-甲基-丁醇、苯乙醇、2，3-丁二醇、己醛、壬醛和3-羥基-2-丁酮等。以四種桑椹為原料，發(fā)酵得到四種蜂蜜桑椹酒，從四種原酒中共檢出93種揮發(fā)性成分，

15、主要成分包括3－甲基-1－丁醇、2－甲基-1-丙醇、苯乙醇、2，3－丁二醇、4－羥基苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸單乙酯、乳酸乙酯、油酸甲酯、乙酸、葵酸、辛酸、3－羥基-2-丁酮等；從四種陳釀酒中共檢出76種揮發(fā)性成分，主要成分包括3－甲基－1－丁醇、2-甲基-1-丙醇、苯乙醇、2，3－丁二醇、1，2，3－丁三醇、4-羥基苯乙醇、3-甲基－丁酸乙酯、2-羥基－丙酸乙酯、乙酸乙酯、3-羥基-2-丁酮等。桑椹從果汁經(jīng)歷發(fā)酵和陳釀作用，香氣成分的種

16、類和相對百分含量變化很大，總體變化趨勢為：低級脂肪酸酯上升，高級脂肪酸酯下降；低級脂肪醇上升，高級脂肪醇變化小，芳香醇上升；低級脂肪酸先升后降，高級脂肪酸大幅下降；酮類上升，醛類下降，酚類先升后降。 本文首次采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，結(jié)合模糊綜合評判方法，構(gòu)建得到適合蜂蜜桑椹酒釀造用的新菌株，該菌株發(fā)酵性能優(yōu)良，且遺傳穩(wěn)定性好；首次對不同品種蜂蜜桑椹酒中各種基本化學成分進行了較全面的研究，著重分析了含有的多酚類物質(zhì)的情況，初步建立了