納米及生物放大技術(shù)用于構(gòu)建高靈敏電化學(xué)免疫分析方法的研究.pdf

1、免疫分析是建立在特異性免疫反應(yīng)基礎(chǔ)之上，結(jié)合現(xiàn)代分析技術(shù)對待測物分析的方法。電化學(xué)免疫傳感器是將免疫識別與高靈敏的傳感技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的一類新型生物分析方法。與傳統(tǒng)的免疫分析相比，電化學(xué)免疫傳感器集免疫反應(yīng)、信號產(chǎn)生、信號檢測為一體，具有能微型化、操作簡單、結(jié)構(gòu)緊湊、靈敏度高、成本低等特點。近年來，基于新型納米技術(shù)、蛋白質(zhì)固定化技術(shù)和信號增強技術(shù)的用于免疫蛋白檢測的電化學(xué)免疫傳感器的研究頗受關(guān)注。然而，在臨床檢測中，通常對單個樣品的

2、檢測成本較高，且批量的檢測會耽誤病人的診斷時間，尤其對于一些急、惡性疾病，早期快速準(zhǔn)確的檢測更是十分重要。因此，具有較高的靈敏度和短的響應(yīng)時間的電流型免疫傳感器逐漸成為人們關(guān)注的課題，尤其是針對痕量標(biāo)志物定量測定。本論文設(shè)計運用復(fù)合納米材料作為生物分子固定化基質(zhì)，同時將酶催化放大、納米技術(shù)放大、現(xiàn)代生物放大技術(shù)等策略與電化學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合，提出幾種新型檢測體系用于免疫蛋白分子的高效準(zhǔn)確的檢測，為其走向臨床奠定基礎(chǔ)。本論文的主要內(nèi)容是：<

3、br>　　 1.基于Nafion/碳納米管/硫堇多層膜的甲胎蛋白免疫傳感器的研究
　　 本研究提出將多壁碳納米管摻雜的Nafion膜首先固載在經(jīng)預(yù)處理的玻碳電極表面，利用Nafion的離子交換作用吸附帶正電荷的硫堇分子，同時在電極表面形成了富含-NH2的功能膜，進一步將金納米顆粒通過其與膜表面功能鍵(-NH2)的共價作用固定在電極上，隨后甲胎蛋白抗體就能通過蛋白質(zhì)分子上氨基或巰基與金形成Au-S鍵或Au-N鍵而將甲胎蛋白抗體共

4、價吸附在電極表面，制得甲胎蛋白電化學(xué)免疫傳感器。其特點在于：該免疫傳感器利用多壁碳納米管比表面積大從而有效增大電極的表面積的特點，將其摻雜于Nafion膜中用于傳感器的構(gòu)建，由于多壁碳納米管的摻雜，可相繼提高電活性物質(zhì)(硫堇)和甲胎蛋白抗體的固載量；另一方面，利用碳納米管的導(dǎo)電性能強，將其摻雜于Nafion膜中可提高膜的導(dǎo)電性，提高電活性物質(zhì)與電極之間的電子傳遞速率，提高該免疫傳感器的檢測靈敏度：另外，將電活性物質(zhì)固載到電極表面可有效防

5、止其對待測物的污染和對檢測的干擾。實驗結(jié)果表明，該免疫傳感器制作方法簡單，固定化抗體分子活性保持良好且固載量大，靈敏度較高，可用于甲胎蛋白的分析測定。
　　 2.自組裝夾心式功能化碳納米管復(fù)合材料構(gòu)建免疫傳感器的研究
　　 在玻碳電極表面自組裝一種夾心式的功能化碳納米管復(fù)合膜，即首先在玻碳電極表面滴涂一層Nation功能化的多壁碳納米管，通過離子交換作用吸附硫堇分子后，利用硫堇分子與金納米顆粒之間的共價鍵合作用組裝一層金

6、納米顆粒功能化的多壁碳納米管，形成一條“金-碳納米管-硫堇-碳納米管-電極”的高效電子傳輸通道。并以此為甲胎蛋白抗體的固定化基質(zhì)，制得電流型甲胎蛋白免疫傳感器。其特點在于：利用多壁納米碳管大的比表面積，提高電活性物質(zhì)硫堇的固載量，增大響應(yīng)信號，提高靈敏度；以雙功能團分子為夾心層，金納米粒子功能化的多壁納米碳管為表層的納米碳管復(fù)合納米材料，雙重增大電極比表面積，提高抗體的固載量的同時可進一步提高電子傳遞速率。實驗結(jié)果表明，用此夾心式自組裝

7、膜來固載抗體蛋白分子制得的電流型免疫傳感器具有更高的靈敏度和良好的選擇性。
　　 3.Oil-water界面固載生物酶的催化微球用于標(biāo)記夾心式免疫傳感器的研究
　　 本研究將生物相容性好的膠原蛋白與半導(dǎo)體納米材料TiO2制得復(fù)合物后，用于捕獲抗體的固載，可有效保持其生物活性的同時提高抗體的固載量。隨后采用恒電位溶出法在其表面沉積一層金納米膜，進一步增大電極的表面積，提高捕獲抗體的固載量。此外，本研究將金納米顆粒、辣根過氧

8、化物酶標(biāo)記的甲胎蛋白抗體(HAFP)、辣根過氧化物酶(HRP)以一定比例先后混合，通過金納米顆粒與蛋白質(zhì)分子上的氨基或巰基共價結(jié)合形成生物耦合物，由于HRP為小分子蛋白，在制備過程中過量的加入HRP可封閉非特異性吸附位點的同時增大酶分子的固載量。加入有機相后，合成的生物耦合物可通過界面的表面張力固定在其表面形成催化微球。此方法制備的催化微球表面固載了大量的HRP和檢測抗體(HAFP)，并將其用于標(biāo)記制備雙抗夾心式免疫傳感器來檢測甲胎蛋白

9、，可通過酶對底物的催化作用來實現(xiàn)檢測信號的放大，提高檢測的靈敏度。本實驗對制備催化微球及其標(biāo)記的免疫傳感器做了表征，并對免疫傳感器的響應(yīng)性能進行研究。結(jié)果表明該信號增強型的電流型免疫傳感器具有制備方法簡單、檢測限低，選擇性等特點。
　　 4.球形二茂鐵功能化石墨烯復(fù)合納米材料標(biāo)記的電化學(xué)免疫傳感器用于豬鏈球菌2型抗原的檢測
　　 采用超聲溶劑置換的方法成功制備出具有電活性的球形羧基二茂鐵，然后通過活化交聯(lián)試劑(EDC/N

10、HS)將其功能化于還原石墨烯上，制得電活性球形二茂鐵功能化的石墨烯，并用于標(biāo)記豬鏈球菌2型多克隆抗體(檢測抗體)。利用石墨烯的致密結(jié)構(gòu)與大的比表面積，可大量固載具球形二茂鐵，繼而提高檢測抗體的固載量及其與識別抗原的結(jié)合效率。本研究基于該納米復(fù)合材料成功制得一種夾心式電化學(xué)免疫傳感器來檢測豬鏈球菌2型抗原。通過抗壞血酸在底液中被球形羧基二茂鐵催化氧化來進一步增強電化學(xué)響應(yīng)信號，提高檢測的靈敏度。
　　 5.鉑納米粒子負載羧基二茂鐵

11、與辣根過氧化物酶結(jié)合物標(biāo)記的滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物用于標(biāo)記信號增強型電化學(xué)免疫傳感器的研究
　　 該夾心式免疫傳感器是采用小分子單鏈DNA(pDNA)通過納米材料標(biāo)記檢測抗體，通過扣鎖探針與之雜交后，在Phi29DNA聚合酶和T4DNA連接酶作用下實現(xiàn)原位擴增，其產(chǎn)物是一條含有多個相同片段的長單鏈DNA。同時將羧基二茂鐵(Fc)與辣根過氧化物酶(HRP)在活化交聯(lián)試劑的作用下混合制得羧基二茂鐵與辣根過氧化物酶的生物結(jié)合物(Fc-HRP)，

12、隨后將其固載在鉑納米粒子上，用于標(biāo)記檢測單鏈DNA(dDNA)。通過其與滾環(huán)復(fù)制的產(chǎn)物的特異性結(jié)合，產(chǎn)生多重放大電化學(xué)信號，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)高特異性、高靈敏的檢測。具有以下特點：該免疫傳感器將滾環(huán)復(fù)制技術(shù)、酶催化放大、納米放大技術(shù)聯(lián)用于多重信號增強型免疫傳感器；通過比表面積大的金納米顆粒固載pDNA，比傳統(tǒng)的共價鍵合作用的固載量大；通過滾環(huán)復(fù)制技術(shù)將pDNA原位延長，其產(chǎn)物擁有多個相同片段，實現(xiàn)信號的第二重放大；使用負載大量Fc-HRP的鉑