HIV-1 耐藥突變對藥效的影響及兩種新藥的活性研究.pdf

1、在人類與艾滋病30多年抗爭的歷程中，抗HIV-1藥物的研發(fā)和應用是取得的最大成就之一。1996年首次將不同種類的藥物聯(lián)合應用，建立了高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（HAART），能夠把HIV-1復制抑制到現(xiàn)有方法檢測不到的水平，大幅度降低了病死率，提高了生存質(zhì)量?；诳共《局委熞约皽p少HIV-1傳播的巨大成功，近幾年國際上把擴大治療和預防性治療作為艾滋病預防控制的新型策略，提倡早治療和對處于感染危險之下的人暴露前/后預防用藥。截至2015年6月，

2、全世界已有約1600萬人接受過艾滋病抗病毒治療。因此，與20年前不同的是，目前HIV-1是在普遍存在的藥物壓力下傳播和進化的。HIV-1具有高度的變異性和極快的復制速率，易在藥物選擇壓力下快速產(chǎn)生耐藥性。目前對所有種類的抗HIV-1藥物均已報道了耐藥毒株，這將導致藥物失效和治療失敗。因此，研發(fā)對耐藥病毒株有效的新型抗HIV-1藥物仍然是艾滋病預防控制的迫切需要。
　　臨床前藥效學研究是抗HIV-1新藥研發(fā)的基礎，對耐藥HIV-1毒

3、株抑制活性的評價是新藥臨床前藥效學研究的重要內(nèi)容。美國FDA抗HIV-1藥物藥效學研究指南建議，將耐藥性研究作為抗病毒藥物藥效學研究的重點。相對于野生型毒株抑制活性的評價，對耐藥毒株的藥效學研究面臨許多特殊問題：（1）我國既往對HIV-1耐藥的研究主要是基因型檢測和分析，尚不具備標準化的表型耐藥檢測方法以及不了解流行毒株的表型耐藥特征。（2）由于已經(jīng)在臨床上使用的抗HIV-1藥物種類較多，病人往往攜帶多種多個耐藥突變，不同突變對藥效的影

4、響不同并難以評估。（3）常規(guī)使用的評估指標（IC50及其與野生毒株相比提高的倍數(shù)）難以準確評估蛋白酶抑制劑（ PIs）和多數(shù)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTIs）耐藥毒株的藥效改變。
　　針對這些問題，本研究首先建立了基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測方法，了解我國主要流行毒株對常用藥物的表型耐藥情況。然后借此方法評估了常用抗病毒藥物對攜帶多種耐藥突變和突變型的HIV-1毒株的抑制活性，提出了一個新的評價參數(shù)。根據(jù)對HIV-1復

5、制和抗HIV-1藥物抑制活性的了解，采用所建立的表型耐藥檢測方法及其他研究方法，利用所建立的評價參數(shù)，對設計的兩個新型抗HIV-1候選藥物（新型蛋白酶抑制劑和針對Vpu-tetherin相互作用的多肽）進行了臨床前抗病毒活性研究，尤其是臨床前耐藥性相關研究，并初步探討了可能的作用機制。
　　第一章基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測方法的建立及我國流行毒株表型耐藥特征的研究
　　目前常用的HIV-1耐藥檢測方法有基因型和表型

6、兩種。基因型耐藥檢測方法由于快速且價格低廉，被廣泛開展。表型耐藥檢測方法由于對實驗室和技術(shù)要求較高開展較少，但是該方法在耐藥位點鑒定以及新型抗HIV-1藥物的活性研究等方面是必須的。我國HIV-1毒株流行呈現(xiàn)復雜的多樣性，目前對HIV-1毒株基因型耐藥的研究較多，但缺乏標準化的表型耐藥檢測方法，對流行毒株的表型耐藥特征亦不了解。本章的目的是建立一種基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測方法，并借此了解我國主要流行毒株對常用抗HIV-1藥物

7、的表型耐藥性，從而對以基因型為基礎的耐藥毒株監(jiān)測結(jié)果提供補充，為制定藥物使用策略以及臨床合理用藥提供依據(jù)。
　　方法與結(jié)果：（1）采集全國10個省市的28例艾滋病患者的血漿標本，收集臨床和流行病學信息。提取純化病毒RNA，巢式RT-PCR擴增獲得gag-pol目的片段，包含編碼蛋白酶的全部密碼子（1-99個）以及逆轉(zhuǎn)錄酶的前312個密碼子。目的片段測序后編輯整理，提交至美國斯坦福大學 HIV耐藥數(shù)據(jù)庫，得到基因型耐藥檢測結(jié)果，系統(tǒng)

8、進化分析得到病毒的基因亞型。病毒的基因型包含 B、CRF01_AE和CRF07_BC，僅2例存在耐藥突變，其余無任何耐藥相關突變。（2）以野生型pNL4.3質(zhì)粒為骨架，將來自病人的gag-pol目的片段克隆至pNL4.3-Δ(SphI-AgeI)上，構(gòu)建重組感染性克隆，轉(zhuǎn)染293T細胞，獲得19株具有穩(wěn)定復制能力的重組病毒。利用MT2/TZM-bl細胞的熒光素酶報告系統(tǒng)，在生物安全三級實驗室檢測重組病毒對6種目前常用一線抗 HIV-1藥

9、物（AZT/3TC/d4T/ddI/NVP/EFV）的表型耐藥性，重復3次，獲得114組表型耐藥檢測數(shù)據(jù)。（3）將基因型和表型耐藥檢測結(jié)果進行比較分析?；蛐团c表型耐藥檢測結(jié)果的一致率為96.5％。1例接受過治療的河南患者（HN2009001）攜帶M41L\L210W\T215Y\K103N\K238T耐藥突變，對6種藥物均表現(xiàn)為耐藥，IC50提高3.92-126.75倍，說明檢測結(jié)果準確。14例未檢出任何耐藥基因突變的患者對6種藥物均

10、敏感，另有4例未檢出任何耐藥基因突變的病人，對NVP或EFV的IC50提高3.41-7.84倍。
　　小結(jié)：建立了一種基于重組病毒的HIV-1表型耐藥檢測和研究方法，多數(shù)表型與基因型耐藥檢測結(jié)果一致，可以對HIV-1的表型耐藥水平進行準確定量評估，為研究HIV-1的耐藥性以及新型抗HIV-1藥物的臨床前藥效學奠定了方法基礎。發(fā)現(xiàn)了基因型無耐藥突變但表型顯示中低度耐藥的病例，提示存在其他導致耐藥的因素，值得深入研究。
　　第二

11、章主要HIV-1耐藥突變及突變型對藥效的影響及新型評價參數(shù)的建立
　　評估藥物對HIV-1耐藥毒株的抑制活性，目前使用的指標是藥物對病毒50%抑制活性（IC50）及其相對于野生毒株提高的倍數(shù)。制定這個指標的前提是假設耐藥突變僅導致劑量反應曲線向右平移，對曲線的形狀沒有影響。而實際上耐藥突變對藥效可產(chǎn)生全面的影響，不僅IC50提高，劑量反應曲線的斜率也會發(fā)生變化，甚至只有斜率的下降。而目前攜帶各類耐藥突變或突變型的病毒對各類抗HIV

12、-1藥物藥效的影響還不清楚，使用的指標也難以準確評估對各類藥物的表型耐藥性。本章的目的是借助第一章所建立的HIV-1表型耐藥檢測方法，闡明主要耐藥突變或突變型對各類抗HIV-1藥物的藥效影響，提出新的考慮了IC50和斜率的評價參數(shù)。
　　方法與結(jié)果：（1）以野生型pNL4.3質(zhì)粒為骨架，定點突變構(gòu)建重組感染性克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染獲得8株能穩(wěn)定復制的攜帶不同耐藥突變的重組病毒。（2）在生物安全三級實驗室測定已上市的10種抗HIV-1藥物對

13、重組病毒的抑制活性，繪制劑量反應曲線，重復3次。結(jié)合實驗室之前已有的數(shù)據(jù)，共獲得22個耐藥毒株對10種抗HIV-1藥物的藥效學數(shù)據(jù)。（3）概括每種突變毒株對各種抗HIV-1藥物的藥效學特征。發(fā)現(xiàn)各類耐藥突變對不同藥物的藥效學參數(shù)影響不同，有三種情況：①僅影響IC50，對斜率無任何影響。多數(shù)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTIs）耐藥突變屬于這種情況；②對 IC50和斜率均產(chǎn)生影響。例如攜帶K103N\H221Y\Y181C\T215Y突變的重

14、組病毒使得EFV的IC50增加13.36倍，同時斜率下降為原來的一半；③僅改變劑量反應曲線的斜率而對IC50無影響。在非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTIs）和蛋白酶抑制劑（PIs）耐藥毒株中這種情況較為多見。例如，攜帶G48V\I54V突變的重組病毒不影響RTV的IC50但降低斜率，攜帶V82A突變的重組病毒株使SQV的斜率降為野生毒株的0.41，但IC50無變化。（4）綜合考慮IC50和斜率，并納入臨床前研究可獲得的最大無毒濃度等數(shù)據(jù)

15、，首次提出新的藥效學評價參數(shù) IIPatoxic，所有藥物的IIPatoxic均與文獻報道的納入臨床最大血藥濃度的參數(shù)IIPmax具有良好的相關性（r>0.95， P＜0.001）。
　　小結(jié)：闡明了常見和主要的HIV-1耐藥突變和突變型對10種抗HIV-1藥物的藥效學特征，發(fā)現(xiàn)不同類型的耐藥突變或突變型對IC50和/或斜率有不同的影響，PIs和NNRTIs耐藥突變對劑量反應曲線的斜率影響最為明顯。首次提出了新的綜合考慮IC50和

16、斜率的可用于臨床前藥效學研究的評價參數(shù)IIPatoxic，可在沒有藥代學數(shù)據(jù)時評估對耐藥毒株的抑制活性，為針對耐藥毒株的臨床前藥效學研究提供了全面準確的評價參數(shù)。
　　第三章新型蛋白酶抑制劑DG35的抗HIV-1活性研究
　　我國目前還沒有一種在臨床應用的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗HIV-1藥物。DG35是我國自主研發(fā)的以HIV-1蛋白酶為靶標的小分子化合物，對其抗HIV-1活性還不清楚。本章旨在評估DG35的臨床前抗HIV-1活

17、性，為該藥的后續(xù)研發(fā)提供臨床前藥效學數(shù)據(jù)。
　　方法與結(jié)果：按照FDA推薦的抗HIV-1藥物臨床前藥效學研究內(nèi)容，采用之前建立的HIV-1表型耐藥研究方法及構(gòu)建的病毒株，利用所建立的評價參數(shù)，采用高通量篩選和評價方法，分別從細胞毒性、對不同基因背景的病毒株的抑制活性、藥物聯(lián)合配伍效果以及加壓誘導耐藥毒株等幾個方面，對DG35進行全面的臨床前活性研究，尤其是臨床前耐藥性研究。研究發(fā)現(xiàn)：（1）DG35在本實驗條件下具有肯定的抗HIV-

18、1的活性，且對野生型參考病毒株（HIV-1NL4.3）的IC50（3.58±0.10nM）低于已在臨床應用的IDV（7.19±1.01nM），斜率（3.42±0.58）高于IDV（2.49±0.23）。（2）DG35對攜帶M46I、I54V、V82A、M46I\N88S和M46I\V82T\I84V耐藥突變病毒株的抑制活性與野生型參考病毒株的抑制活性相當（1.02-12.46nM）。與HIV-1NL4.3相比，攜帶蛋白酶抑制劑耐藥突變（

19、G48V\I54V）的毒株對DG35不僅IC50提高了65.57倍，且劑量反應曲線的斜率也發(fā)生變化，其IIPatoxic值亦下降。而DG35對3株NNRTIs耐藥毒株具有良好的抑制活性。（3） DG35與AZT（NRTI）、EFV（NNRTI）和RTV（PI）均有高度的協(xié)同抗HIV-1作用，協(xié)同指數(shù)分別為592.28nM2%、661.33nM2%和528.72nM2%。（4）體外藥物加壓誘導培養(yǎng)，連續(xù)傳6代，未誘導出DG35的耐藥毒株。

20、
　　小結(jié)：DG35對實驗室傳代毒株具有較強的抑制活性，對于常見的PIs耐藥毒株也有一定的抑制活性，但對攜帶G48V\I54V和G48V\I54V\V82A突變的蛋白酶抑制劑耐藥毒株的活性有所下降，與NNRTIs無交叉耐藥性。與目前臨床使用的三種抗HIV-1藥物具有高度協(xié)同作用，同時具有較高的耐藥基因屏障。這些結(jié)果為該藥的后續(xù)研發(fā)奠定了基礎。
　　第四章以Vpu-tetherin相互作用為靶標的抗HIV-1多肽的設計和活性研

21、究
　　HIV-1幾乎對于目前已上市的所有藥物均出現(xiàn)了耐藥性，需要研究針對新靶點的藥物。Tetherin（THN）是宿主細胞表面的蛋白，可以將HIV-1粘附到細胞表面阻斷其出芽復制，是人體細胞天然的抗病毒機制。HIV-1在進化過程中獲得了Vpu，利用細胞內(nèi)蛋白降解途徑介導tetherin降解，從而對抗細胞的天然抗病毒功能。阻斷Vpu對tetherin的降解作用是有前景的抗HIV-1新靶標，然而到目前為止，還沒有報道任何一種小分子或

22、者多肽可以阻斷Vpu與tetherin的相互作用。本章的目的是設計針對Vpu-tetherin相互作用的抗HIV-1多肽，進行活性驗證，探討可能的作用機制，為新靶點藥物研發(fā)提供新的思路。
　　方法與結(jié)果：（1）檢索野生型參考病毒株HIV-1NL4.3 Vpu的氨基酸序列，以10個氨基酸為一個跨度，設計、合成了7條可能競爭性阻斷Vpu與tetherin結(jié)合的Vpu多肽類似物。同時從Vpu多肽中隨機選擇20個氨基酸合成2條隨機多肽，作

23、為對照。（2）利用前期建立的藥效學研究方法進行抑制活性的確證。獲得了3條具有一定抑制活性的多肽，分別命名為CJ128、CJ130和CJ131，IC50分別為4.29±0.05μM、3.75±0.13μM和3.50±0.21μM，而兩條隨機多肽對于HIV-1NL4.3未表現(xiàn)出任何抑制活性。（3）Vpu和tetherin在細胞內(nèi)共表達，Western blot實驗表明CJ128和CJ130可以恢復tetherin的表達水平，多肽可能通過阻斷

24、Vpu介導的tetherin的降解以抑制HIV-1的復制。（4）激光掃描共聚焦顯微成像發(fā)現(xiàn)所有活性多肽確實結(jié)合于細胞表面，從而可能與存在于細胞表面的tetherin結(jié)合而發(fā)揮抑制作用，而對照多肽則無此現(xiàn)象。
　　小結(jié)：設計合成了3條具有潛在抗HIV-1活性的多肽，可抑制Vpu依賴的病毒顆粒的釋放，證實其定位于細胞表面，可能與 Vpu競爭性地結(jié)合存在于細胞表面的tetherin，對 Vpu介導的tetherin的降解產(chǎn)生一定的阻斷作