基因突變敏感性分子開關檢測HIV-1耐藥基因突變.pdf

1、目的：利用高保真聚合酶介導的突變敏感性分子開關，建立對HIV-1七個耐藥突變位進行快速篩查的技術平臺，采用單一PCR和多重PCR相結合，檢測耐藥基因相關突變的有無，為HIV耐藥性評估提供依據(jù)，指導HIV患者合理用藥。
　　方法：將包含HIV-1耐藥突變的PCR產物克隆至pMD-19-T載體，通過含氨芐的LB平板篩選陽性克隆，挑選菌落進行培養(yǎng)并提取質粒DNA。對質粒DNA進行PCR擴增初步確定陽性克隆，并通過測序分析確證，獲得包含H

2、IV-1耐藥突變相對應的野生型質粒模板。突變型模板直接由公司合成，包含目前已知的HIV-1耐藥突變二十七個，本研究選擇七個高頻突變位點建立快速檢測體系。所選七個突變位點分別是M41L(ATG/CTG)、K65R(AAA/AGA)、T69N(ACT/AAT)、M184V(ATG/GTG)、V75I(GTA/ATA)、V82A(GTC/GCC)和L90M(TTG/ATG)。實驗以這七個突變位點為檢測靶點，分別設計3’末端與野生型基因位點或突

3、變基因位點配對的引物，硫化磷酸修飾3’末端并偶聯(lián)高保真DNA聚合酶構成的基因突變敏感性分子開關。首先在不同體系分別對含有相應七個突變的突變質粒模板及野生型質粒模板進行引物延伸反應，并通過凝膠成像系統(tǒng)對其進行分析；然后在同一體系同時對含有相應七個突變的突變質粒模板及野生型質粒模板進行引物延伸反應，并通過凝膠成像系統(tǒng)對其進行分析；最后結合熒光定量分析進行檢測。
　　結果：在不同反應體系分別對七個熱點突變進行檢測。在一定的反應條件及反應

4、體系下，特異性野生檢測引物與野生模板配對得以延伸；而與突變模板不配對則不能延伸。當特異性突變檢測引物與突變模板配對，引物得以延伸；而與野生模板不配對則不能延伸。結果顯示，使用野生型質粒模板，該方法僅能使野生型等位基因相關引物得以延伸，而突變等位基因位點特異性引物不能被延伸。反之，使用突變質粒模板，該方法僅能使突變型等位基因位點相關引物得以延伸，而野生型等位基因位點特異性引物不能被延伸。在同一反應體系同時對以上熱點突變進行檢測。同樣，完全

5、配對引物能被延伸，不完全配對引物不能被延伸。分子開關對上述七個位點的識別敏感性大部分可達到101~109拷貝，特異性分別為104~105拷貝，這一特定引物擴增特定模板的特異性在突變與野生序列之間的達到3個或3個以上對數(shù)級，能有效早期檢測耐藥突變。
　　結論：高保真酶介導的突變敏感性分子開關可用于已知基因突變的檢測，除可用于檢測某些遺傳性突變外，還可以檢測耐藥基因突變。高保真DNA聚合酶偶聯(lián)硫化修飾引物構成的突變敏感性分子開關能夠快