HIV-1耐藥與宿主遺傳因素的相關(guān)性研究.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原體，能夠引起以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p壞為特征的傳染性疾病，近30年來在全球肆虐流行，給人類的生命安全、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會進(jìn)步造成了十分嚴(yán)重的危害，已經(jīng)引起了各國政府和社會的普遍關(guān)注[1]。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretr

2、oviral therapy,HAART)能夠有效地抑制HIV-1感染者體內(nèi)病毒的復(fù)制，延長壽命并提高生活質(zhì)量。然而HIV-1耐藥的出現(xiàn)極大地削弱了HAART的療效，并已成為抗病毒治療失敗的主要原因。HIV-1耐藥的產(chǎn)生是宿主、病毒和抗病毒藥物共同作用的結(jié)果。我國自2004年開展HIV耐藥研究以來，研究工作主要圍繞耐藥毒株發(fā)生和進(jìn)化規(guī)律、耐藥毒株檢測方法等展開，尚未有我國人群遺傳因素與HIV-1耐藥關(guān)系的研究。本課題首先對我國部分地區(qū)接

3、受抗病毒治療的艾滋病患者中HIV-1耐藥毒株流行的狀況進(jìn)行了橫斷面研究，然后分析了我國流行的主要HIV-1毒株耐藥突變位點亞型間的分布差異，在掌握耐藥毒株流行狀況的基礎(chǔ)上，對我國HIV-1感染人群體內(nèi)參與抗病毒藥物吸收、分布、代謝及排泄(absorption，distribution，metabolism and excretion,ADME)的一系列酶和蛋白編碼基因的多態(tài)性情況及其與HIV-1耐藥發(fā)生的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)、深入的研究，旨在

4、為臨床制定延緩病毒耐藥產(chǎn)生的方法和策略、實現(xiàn)個體化治療、確保抗病毒治療效果及為實現(xiàn)我國有限的抗HIV藥物資源的長期、可持續(xù)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
　　第一部分:我國部分地區(qū)HIV-1感染者耐藥現(xiàn)狀研究
　　為了解和掌握我國接受抗病毒治療的艾滋病患者中HIV-1耐藥毒株的流行狀況，采用基于擴增測序的經(jīng)典HIV-1基因型耐藥檢測方法，對河北省、山西省及北京協(xié)和醫(yī)院收治的共322例艾滋病患者進(jìn)行了基因型耐藥檢測，分析了人群耐藥情況及與

5、耐藥發(fā)生相關(guān)的因素。主要結(jié)果如下:
　　1.322例艾滋病患者的耐藥率為46.5％，河北、山西及北京協(xié)和醫(yī)院患者的耐藥率分別為50.0％、56.5％和14.7％，地區(qū)差異顯著(Fisher's exact test，p＜0.05)。
　　2.不同地區(qū)樣本耐藥突變位點的分布無顯著性差異，常見耐藥突變位點均為M41L、D67N、K70R、K101E、K103N、Y181C、M184V、G190A、T215F及T215Y，其中K1

6、03N、Y181C和M184V分布頻率最高，分別為17.5％、12.9％和29.0％。
　　3.抗病毒藥物耐藥率依次為NVP46.2％、3TC32.8％、EFV30.1％、d4T20.7％、AZT12.2％、TDF5.9％，存在嚴(yán)重的交叉耐藥導(dǎo)致對一些未曾使用過的藥物耐藥，如ABC、RPV和ETR耐藥率分別達(dá)到33.2％、24.4％、22.6％。
　　4.統(tǒng)計學(xué)分析顯示HIV-1的感染途徑對耐藥程度具有顯著影響（性傳播:敏感

7、55.4％、潛在耐藥5.0％、低度耐藥2.5％、中度耐藥1.7％、高度耐藥35.5％;血液傳播:敏感38.3％、潛在耐藥5.0％、高度耐藥56.7％，Kruskal-Wallis test，p＜0.05);性別(男:D67N4.6％、Y181C9.3％、M184V23.2％、G190A7.3％,女:D67N1.7％、Y181C23.3％、M184V41.7％、G190A11.7％)和感染途徑(性傳播:M41L1.7％、K103N14.9

8、％、Y181C8.3％、T215 F/Y4.2％，血液傳播:M41L13.3％、K103N25.0％、Y181C20.0％、T215F/Y15.0％)對耐藥突變類型的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義(Multinomial Logistic Regression，p＜0.05)。
　　第二部分:我國流行HIV-1毒株不同亞型間耐藥突變位點的差異分析
　　HIV-1具有高度的變異性，可分為M、N、O及P4個群，其中M群包含9個亞型、55個流

9、行重組型（circulating recombinant form，CRF）以及難以計數(shù)的獨特重組型(unique recombinant form，URF)，各個變異毒株的基礎(chǔ)基因序列不同，在藥物壓力下耐藥選擇和發(fā)生的路徑及難易程度也各不相同。目前幾乎所有抗病毒藥物的耐藥數(shù)據(jù)都是基于B亞型而獲得的，而我國流行的主要HIV-1毒株是CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_ BC和B亞型。為了解我國HIV-1主要流行毒株耐藥突變位

10、點的分布差異，為優(yōu)化臨床治療方案、提高抗病毒治療效果提供指導(dǎo)，我們以5442條HIV-1 pol區(qū)基因序列（按照來源分，本實驗室積累1483條、云南省艾滋病關(guān)愛中心提供335條、自HIV sequence database下載3624條;按照亞型分，CRF01_AE序列1696條、CRF07_BC序列502條、CRF08_BC序列924條和B亞型序列1984條）作為研究對象，分析了HIV-1不同亞型間pol區(qū)基因耐藥突變位點的氨基酸分布

11、差異及其原因。主要結(jié)果如下:
　　1.不同亞型病毒間逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)19個耐藥突變位點的氨基酸分布存在顯著差異(chi-square test，p＜0.05)，發(fā)生頻率占前5位的突變分別是:B亞型毒株，103、215、181、184、190; CRF01_AE,238、184、190、181、103;CRF08_BC，184、103、69、181、101/190。蛋白酶(PR)區(qū)17個耐藥突變位點的氨基酸分布存在顯著差異，發(fā)生頻

12、率占前5位的突變分別是:B亞型毒株，89、63、77、93、35; CRF01_ AE,89、36、35、93、63; CRF07_BC,63、89、93、35、77; CRF08_ BC,93、36、63、89、82。
　　2.B亞型、CRF01_AE和CRF08_BC毒株逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)5個耐藥突變位點（69、138、181、215和238）的氨基酸由野生型轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幮退韬塑账嵬蛔兊姆N類和數(shù)量即基因屏障存在顯著差異(Kru

13、skal-Wallis test，p＜0.05)，提示亞型對耐藥突變的產(chǎn)生具有一定的影響。
　　3.大部分耐藥突變位點是在各亞型序列多態(tài)性位點的基礎(chǔ)上發(fā)生的，多態(tài)性位點在抗病毒藥物的選擇下易發(fā)生耐藥突變。
　　4.不同亞型病毒中分布頻率最高的耐藥突變位點(＞20％)均為K103、Y181和M184，偏嗜耐藥突變位點(＞10％)基本一致，且B亞型毒株中的耐藥突變均存在于其他非B亞型毒株中。
　　5.目前人群水平上HIV-

14、1不同亞型病毒的治療方案及耐藥突變位點的偏嗜情況基本一致，因此推斷針對B亞型設(shè)計的抗病毒藥物及治療方案同樣適用于包括CRF01_ AE、CRF07_ BC及CRF08_BC等在內(nèi)的其他非B亞型病毒。
　　第三部分:宿主基因多態(tài)性與HIV-1耐藥的相關(guān)性研究
　　HIV-1耐藥是病毒、宿主和抗病毒藥物共同作用的結(jié)果。宿主參與抗HIV藥物吸收、分布、代謝及排泄的一系列酶或蛋白編碼基因上的單核苷酸多態(tài)性位點(single nucl

15、eotide polymorphism site，SNPs)，能夠影響抗HIV藥物的藥代動力學(xué)和/或藥效學(xué)，進(jìn)而影響血漿藥物濃度及藥物選擇壓力，導(dǎo)致不能形成和/或維持對病毒的有效抑制，從而出現(xiàn)耐藥。分析并闡明宿主基因多態(tài)性與HIV-1耐藥的關(guān)系，可以為臨床上延緩HIV-1耐藥的發(fā)生、優(yōu)化抗病毒治療方案乃至個體化治療提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。目前，國外相關(guān)研究大多集中或者局限于藥物藥代動力學(xué)和/或藥效學(xué)的改變，且多為單一基因或針對單一藥物的

16、研究，未見宿主基因多態(tài)性與HIV-1耐藥相關(guān)性的研究報道。在本研究中，首先采用PCR擴增和測序的方法檢測了與常用抗病毒藥物代謝密切相關(guān)的CYP(2B6、2C9及3A4)基因的SNPs在129例艾滋病患者體內(nèi)的存在、分布情況，并對其與HIV-1耐藥的關(guān)系進(jìn)行了分析;其次建立了檢測人體47個參與抗HIV藥物吸收、分布、代謝及排泄的一系列酶或蛋白編碼基因上SNPs的MassARRAY方法，然后檢測了這些SNPs在810例具有良好服藥依從性的艾

17、滋病患者（北京協(xié)和醫(yī)院475例、云南省艾滋病關(guān)愛中心335例）中的分布情況，并測定了153例艾滋病患者NVP的血漿藥物濃度，結(jié)合臨床資料，對這些SNPs與HIV-1耐藥發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行了深入分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.成功構(gòu)建了CYP（2B6、2C9及3A4）基因外顯子區(qū)域及外顯子-內(nèi)含子結(jié)合部SNPs的檢測方法，共檢測SNPs70個，其中分布頻率＞5％的SNPs17個，大部分位點為NCBI SNPdb或Hapmap所收錄且

18、分布于內(nèi)含子區(qū)域，CYP2C9g.10417和CYP3A4 g.20446為新鑒定多態(tài)性位點。
　　2.通過文獻(xiàn)閱讀、資料分析，結(jié)合我國使用的抗HIV藥物，確定了47個人體參與抗HIV藥物吸收、分布、代謝及排泄的酶或蛋白編碼基因上的SNPs，主要集中在細(xì)胞色素P450基因和ABC家族基因上。
　　3.設(shè)計了141條引物（47對擴增引物，47條延伸引物），建立并優(yōu)化了檢測47個SNPs等位基因堿基類型的MassARRAY方法，

19、完成了810例接受抗病毒治療的艾滋病患者標(biāo)本（敏感標(biāo)本600份vs.耐藥標(biāo)本210份）的檢測，首次獲得了47個SNPs在我國HIV-1感染/艾滋病人群中分布的數(shù)據(jù)，rs3892097(0.012vs.0.106)、rs12248560(0.012vs.0.152)、rs2740574(0.002vs.0.202)及rs7439366(0.004vs.0.126)等4個位點的等位基因分布與國外研究結(jié)果存在較大差異。
　　4.單因素分

20、析顯示rs8192726、rs3745274、rs2279343、rs4646437、rs776746、rs17222723、rs899494、rs2274407、rs2231142、rs2231137及rs9264942等11個SNPs在抗病毒治療敏感-耐藥人群間的等位基因分布存在顯著差異(Fisher's exact test，p＜0.05);多因素分析顯示rs2779343、rs776746、rs9264942及基線病毒載量等因素

21、與HIV-1耐藥的產(chǎn)生存在顯著相關(guān)性(Binary Logisticanalysis，p＜0.05)，其中rs2779343AG/GG、rs776746GG、rs9264942TT及基線高病毒載量為耐藥發(fā)生的危險因素，OR分別為3.536/4.283、2.141、1.316和3.038，值得深入研究。
　　5.完成153份標(biāo)本的血漿藥物濃度的檢測，并分析了血漿藥物濃度與HIV-1耐藥的關(guān)系。
　　第四部分:宿主BST-2基因

22、與HIV-1 Vpu基因多態(tài)性的相關(guān)性研究
　　宿主BST-2基因編碼的黏合素蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一種抗病毒蛋白，是人體細(xì)胞內(nèi)天然免疫機制的重要組成部分，能夠有效地抑制體內(nèi)HIV-1 Vpu缺陷病毒的復(fù)制。Vpu蛋白是HIV-1克服黏合素抗病毒作用的關(guān)鍵蛋白，能夠有效對抗黏合素蛋白的抗病毒作用，保證HIV-1復(fù)制的正常進(jìn)行。闡明BST-2基因多態(tài)性并分析其與HIV-1 Vpu基因多態(tài)性間的關(guān)系，有助于深入理解HIV-1的致病機制。主

23、要研究結(jié)果如下:
　　1.建立了宿主BST-2基因多態(tài)性的檢測方法，檢測到13個高頻SNPs，其中9個為NCBI SNPdb或Hapmap所收錄，4個為新鑒定位點，并對這些SNPs的分布及連鎖情況進(jìn)行了分析。
　　2.建立了檢測上述13個SNPs等位基因的MassARRAY方法，并完成810例樣本的檢測。
　　3.建立了HIV-1 Vpu基因的擴增方法，成功獲得413條序列，分析顯示不同亞型間Vpu基因氨基酸分布存在較