河南某地HIV-1耐藥毒株的流行狀況及新型耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)研究.pdf

1、HIV-1毒株的耐藥性是艾滋病抗病毒治療的主要障礙，闡明耐藥毒株的流行狀況及分子進(jìn)化規(guī)律，對于認(rèn)識HIV耐藥的機(jī)制、指導(dǎo)抗病毒治療具有重要的意義。本研究首先對國內(nèi)使用的in-house HIV基因型耐藥性檢測方法進(jìn)行了評價，然后利用經(jīng)過評價的in-house耐藥檢測方法對2009年河南省某地的艾滋病患者進(jìn)行了耐藥毒株流行狀況的橫斷面研究，分析了耐藥發(fā)生情況及對治療的影響，為改進(jìn)治療方案提供依據(jù)。引入并改進(jìn)了HIV準(zhǔn)種的單基因組擴(kuò)增法(S

2、ingle-Genome Amplification，SGA)，并用這種方法分析了一名接受蛋白酶抑制劑治療的艾滋病患者體內(nèi)印地那韋耐藥準(zhǔn)種的發(fā)生、發(fā)展過程，確定了新型印地那韋耐藥突變模式。最后，根據(jù)在河南HIV耐藥分子流行病學(xué)研究的結(jié)果，對篩選出來的與抗病毒治療失敗相關(guān)的新型突變位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，通過構(gòu)建突變病毒及表型耐藥性研究，分析這些突變位點(diǎn)對耐藥的作用。
　　 第一部分 In-house HIV-1基因型耐藥性檢測方法的評價

3、
　　 目的：評價國內(nèi)建立并廣泛使用的in-house HIV-1基因型耐藥檢測方法的準(zhǔn)確性與敏感性。
　　 方法：以美國FDA批準(zhǔn)的HIV-1基因型耐藥性檢測系統(tǒng)(ViroSeqTM v2.0，雅培)為參比，兩種方法平行檢測130份艾滋病患者的血漿樣本，比較二者在耐藥突變位點(diǎn)檢測以及耐藥性解釋方面的一致性。
　　 結(jié)果：兩種方法均得到耐藥結(jié)果的樣本有110例。在已知的14850個HIV-1耐藥突變位點(diǎn)中，兩種方

4、法可同時檢出99.34％(14752/14850)的耐藥突變位點(diǎn)(kappa值為0.9488，P值<0.00001)。在對不同類型的突變位點(diǎn)檢測中，兩種方法對蛋白酶抑制劑耐藥突變位點(diǎn)、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥突變位點(diǎn)檢測的一致率分別為99.70％和99.01％(kappa值分別為0.9099和0.9521，P值均<0.00001)。兩種方法出具耐藥檢測報告結(jié)果的一致率為94.55％(kappa值為0.6374，P值<0.0001)，表明兩種方

5、法在藥物敏感性評價方面具有高度一致性。兩種方法共檢測到34個ViroSeqTM數(shù)據(jù)庫(ViroSeqTM軟件v2.7)未收錄的位點(diǎn)，這些突變位點(diǎn)在SHDB數(shù)據(jù)庫中對耐藥性有一定影響。其中2個突變位點(diǎn)(逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的V179F和K238T)對耐藥的影響較大，提示in-house方法的數(shù)據(jù)庫(SHDB)與ViroSeqTM相比具有一定優(yōu)勢。
　　 結(jié)論：In-house基因型耐藥性檢測方法與ViroSeqTM基因型耐藥性檢測系統(tǒng)在耐藥

6、突變位點(diǎn)檢測以及藥物敏感性評價上具有高度一致性，是一種快速準(zhǔn)確、性價比高的HIV-1基因型耐藥檢測方法。
　　 第二部分河南省某地HIV-1耐藥毒株流行狀況的橫斷面研究
　　 目的：了解我國河南省某縣艾滋病患者的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的效果、免疫重建的情況和耐藥性發(fā)生情況，為改進(jìn)抗病毒治療方案、提高療效提供依據(jù)。
　　 方法：對某縣120名2003年或2004年開始接受抗病毒治療的艾滋病患者進(jìn)行橫斷面研究。對每一名患者

7、進(jìn)行了面對面訪談，了解患者的臨床表現(xiàn)、服藥依從性等情況。經(jīng)患者知情同意，采集10ml抗凝血。通過測定患者的病毒載量和CD4+T計(jì)數(shù)評價抗病毒治療效果和免疫恢復(fù)情況，采用in house方法對治療失敗的患者進(jìn)行了基因型耐藥性檢測。
　　 結(jié)果：120名艾滋病患者使用了三種抗病毒治療方案，分別為AZT/DDI/NVP組(n=102)；AZT/3TC/NVP組(n=12)；D4T/3TC/NVP組(n=6)?；颊叩腃D4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)平

8、均值為377±218 cells/ml，中位數(shù)為367 cells/ml，其中CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)大于350 cells/ml的患者有64例(53.3％)。33例患者的HIV-1病毒載量小于檢測限，其余患者病毒載量平均值為4.09±1.10 lg拷貝/毫升(中位數(shù)為3.87 lg拷貝/毫升)。在114例具有病毒載量數(shù)據(jù)的患者中，67例(58.77％)患者治療失敗(病毒載量大于1000拷貝/毫升)。經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn)，三種治療方案治療效

9、果之間沒有顯著性差異(P=0.53)。對治療失敗的患者(病毒載量大于1000拷貝/毫升)進(jìn)行基因型耐藥性檢測，共67份標(biāo)本，得到58份(86.6％)基因型耐藥結(jié)果。其中40份產(chǎn)生了逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥性，治療失敗患者中的耐藥發(fā)生率為69.0％(40/58)；蛋白酶抑制劑耐藥發(fā)生率為0.0％(0/58)。治療失敗患者中核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥發(fā)生率為53.4％(31/58)；非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥發(fā)生率為67.2％(39/58)。核苷

10、類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑中，AZT的耐藥發(fā)生率最高(39.66％，23/58)，非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑中，NVP的耐藥發(fā)生率最高(67.24％，39/58)。分析耐藥患者的耐藥水平，發(fā)現(xiàn)患者產(chǎn)生的耐藥性基本上為中高度耐藥，并且具有交叉耐藥性。M41L、T215Y是耐藥發(fā)生率最高的NRTIs類突變；K103N、Y181C是耐藥發(fā)生率最高的NNRTIs類突變。
　　 結(jié)論：河南某縣目前艾滋病患者的抗病毒治療效果和免疫恢復(fù)均不理想，耐藥毒株流

11、行嚴(yán)重，目前的治療方案已不適用，建議改變治療方案，換用蛋白酶抑制劑。
　　 第三部分新型HIV-1耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)的鑒定
　　 由于HIV-1的流行毒株亞型不同、抗病毒治療模式不同及長期的病毒/宿主/藥物相互作用，新型HIV耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)。逆轉(zhuǎn)錄酶是抗病毒藥物最重要的靶點(diǎn)，已經(jīng)鑒定了很多對藥物敏感性影響非常大的突變位點(diǎn)，但這些突變位點(diǎn)主要位于具有催化活性的聚合酶區(qū)，連接區(qū)的耐藥突變位點(diǎn)近幾年才被發(fā)現(xiàn)。

12、　　 目的：鑒定前期研究篩選出來的新型逆轉(zhuǎn)錄酶基因突變位點(diǎn)對于耐藥的作用。
　　 方法：利用定點(diǎn)突變和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建含有相關(guān)突變的HIV-1 pNL4.3病毒株。通過測定3種藥物(AZT、EFV和NVP)對突變型和野生型病毒株對的50％抑制濃度(50％inhibitory concentration，IC50)，確定突變位點(diǎn)對藥物敏感性的影響。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建7個突變病毒株，分別含有HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因的D

13、123E、V292I、K366R、T369A、T369V、A371V和I375V突變。(1)A371V和T369V可使病毒對AZT的IC50分別增加3.60和2.83倍，其它5個突變卻在一定程度上提高病毒對AZT的敏感性，特別是T369A，使病毒對AZT的IC50值降低35.67倍。(2)T369V和A371V可以導(dǎo)致EFV的低度耐藥，IC50分別增加4.55和2.87倍數(shù)，其它5個突變可提高病毒對EFV的敏感性，特別是I375V，單獨(dú)

14、出現(xiàn)時可使病毒的IC50由8.11nM降低到1.23nM，降低了6.7倍。(3)突變T369V可導(dǎo)致病毒對NVP的耐藥性，IC50增加11.55倍。其它突變對NVP耐藥性的影響很小。
　　 結(jié)論：A371V可以導(dǎo)致低度AZT耐藥(FC=3.60)，T369V分別可以導(dǎo)致EFV、NVP的低度和中度耐藥(FC=4.55，11.55)。首次證實(shí)HIV-1連接區(qū)的T369位點(diǎn)對AZT、EFV和NVP耐藥性的影響均較大，T369A突變可提

15、高病毒對AZT和EFV的敏感性，而T369V突變卻導(dǎo)致對AZT、EFV和NVP的耐藥性。
　　 第四部分單基因組擴(kuò)增法分析HIV-1印地那韋耐藥準(zhǔn)種的分子進(jìn)化
　　 HIV-1在感染者體內(nèi)以準(zhǔn)種形式存在，耐藥毒株與野生毒株共存，在不同的藥物壓力下，呈動態(tài)的進(jìn)化和發(fā)展過程。認(rèn)識HIV-1耐藥準(zhǔn)種在體內(nèi)的進(jìn)化路徑是闡明耐藥機(jī)制的基礎(chǔ)。
　　 目的：利用單基因組擴(kuò)增法(Single-Genome Amplificati

16、on，SGA)分析一名長期服用逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、剛剛將奈韋拉平(Nevirapine，NVP)改為印地那韋(Indinavir，IDV)的艾滋病患者(XLF)體內(nèi)IDV耐藥準(zhǔn)種的產(chǎn)生及發(fā)展情況。
　　 方法：對患者進(jìn)行連續(xù)隨訪，采集6份系列血漿標(biāo)本，包括服用IDV之前的1次樣本(XLF1)和服用IDV之后的5次(XIF2至XLF6)樣本。利用SGA法得到病毒聚合酶區(qū)(包括逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶全長)的準(zhǔn)種序列，將得到的序列提交斯坦福大學(xué)

17、HIV-1耐藥數(shù)據(jù)庫，得到耐藥信息。
　　 結(jié)果：從6份系列樣本中共得到了149條蛋白酶全長和171條逆轉(zhuǎn)錄酶全長序列，所有序列均為B亞型?；颊叻肐DV之前，病毒的蛋白酶區(qū)只含一些多態(tài)性突變位點(diǎn)。服用IDV之后，含蛋白酶區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)的病毒比例下降，而含有次級突變位點(diǎn)G73S的病毒開始上升，并成為優(yōu)勢毒株。隨著治療時間延長，G73S與M46I/L90M組成一個連鎖的耐藥突變模式-M46I/G73S/L90M，并逐漸取代G73S成