基因工程制備微藻生物柴油中兩項關(guān)鍵技術(shù)的研究.pdf

1、近年來隨著化石燃料消費的不斷提高導(dǎo)致了越來越嚴(yán)重的能源危機和環(huán)境問題，微藻生物柴油作為一種優(yōu)勢明顯新興能源越來越受到人們的重視。本研究的目的對微藻生物柴油的開發(fā)利用中兩項關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行研究，為微藻生物柴油的廣泛利用提供一定的技術(shù)支持。在利用微藻制備生物柴油時，用基因操作能有效、穩(wěn)定的提高微藻的產(chǎn)油率。其中，選擇合適的藻種、目的基因是基因操作的關(guān)鍵。本研究選擇了生長速率較高，可在海水中生長的海水小球藻作為藻種，海水小球藻pepc2基因作為目

2、的基因進(jìn)行研究。首先通過克隆和生物信息學(xué)方法分析了海水小球藻pepc2基因的結(jié)構(gòu)特征；再通過反義原核表達(dá)分析了海水小球藻pepc2基因的功能。除此之外，本研究還探索了基于光反應(yīng)器的微藻規(guī)模化培養(yǎng)技術(shù)，利用本課題組設(shè)計的100L光反應(yīng)器規(guī)模化培養(yǎng)微藻，分析其生長規(guī)律和調(diào)控方式。
　　PEPC酶(PEPCase:EC4.1.1.31)是光合碳代謝過程中的一個重要的酶，它催化磷酸烯醇式丙酮酸β-羧化生成草酰乙酸和無機磷酸。近20年來，研

3、究發(fā)現(xiàn)在非C4和CAM植物，如藻類中也廣泛存在這種酶，并且證明在真核藻類中存在兩種類型PEPC酶，但對其功能尚不清楚。為了進(jìn)一步了解藻類 PEPC酶的特征，本文對海水小球藻pepc2基因進(jìn)行了首次克隆并通過生物信息學(xué)方法分析了海水小球藻PEPCase2的結(jié)構(gòu)和功能特征。主要實驗結(jié)果如下：1.系統(tǒng)進(jìn)化分析表明海水小球藻pepc2基因與萊茵衣藻pepc2基因親緣關(guān)系較近；氨基酸序列特征分析表明海水小球藻PEPCase2的肽鏈共包含5個保守序

4、列區(qū)，2個催化活性位點，其N端缺乏絲氨酸可逆磷酸化位點，C端為RNTG結(jié)構(gòu)。由此可知該基因編碼的是海水小球藻細(xì)菌型PEPC酶；2.海水小球藻 PEPCase2二級結(jié)構(gòu)主要包括α螺旋，β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和伸展鏈；其三級結(jié)構(gòu)外部為α螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲，有利于保持PEPC酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，中心的平行β桶結(jié)構(gòu)為PEPC酶的反應(yīng)中心；3.海水小球藻 PEPCase2具有多種重要的生理功能，主要與多種重要的物質(zhì)合成有關(guān)。
　　本研究用反義載體

5、技術(shù)在大腸桿菌中反向表達(dá)了海水小球藻pepc2基因片段，抑制PEPC酶活性從而提高油脂含量。通過PCR擴增獲得的海水小球藻pepc2基因片段經(jīng)測序為611bp，與海水小球藻pepc2基因相似度為100％，該片段編碼海水小球藻PEPCase2保守序列Ⅰ。將該片段插入 pET-28a構(gòu)建正向（pET-28a-forw-pepc2）和反向（pET-28a-reve-pepc2）表達(dá)載體，并導(dǎo)入到大腸桿菌獲得正義和反義轉(zhuǎn)基因大腸桿菌。在誘導(dǎo)條件

6、下培養(yǎng)，與野生型相比，誘導(dǎo)6h時正向表達(dá)突變體pepc基因相對表達(dá)量、PEPC酶活性、可溶性蛋白含量分別提高至215.74%、5.59 U/g prot和216.96mg/g biomass而總油脂下降至3.67%；反向表達(dá)突變體則相應(yīng)分別下降到41.23%、2.83U/g prot和139.19mg/g biomass，總油脂提高了24%。表明pepc基因在大腸桿菌蛋白和脂類代謝方面起著重要調(diào)控作用。
　　為了實現(xiàn)微藻的規(guī)?；?/p>