玉米秸稈蛋白發(fā)酵飼料木質(zhì)纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育及應(yīng)用.pdf

1、世界上纖維原料資源豐富,將纖維資源轉(zhuǎn)化后可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)酒精、單細(xì)胞蛋白等物質(zhì)的目的。這不僅充分利用了自然資源,而且防止了由于纖維原料的丟棄產(chǎn)生的污染。其中纖維原料轉(zhuǎn)化是實(shí)現(xiàn)纖維原料合理化利用的重要步驟。纖維原料的轉(zhuǎn)化包括纖維原料的預(yù)處理和纖維素酶的酶解。本文主要從纖維原料秸稈的預(yù)處理及纖維素酶的生產(chǎn)兩個(gè)重要方面進(jìn)行了探討。
　　首先通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了玉米秸稈高壓蒸煮鍋中蒸煮的最佳預(yù)處理?xiàng)l件:用堿量為14％、固液比為1:7、保溫溫度為

2、130℃1h+140℃1h,該預(yù)處理?xiàng)l件下處理后的玉米秸稈其紙漿卡伯值出現(xiàn)最低,殘堿和紙漿得率也較為合理。此時(shí)其卡伯值為12.43,制漿得率為56.7%。隨后利用購買的纖維素酶及木聚糖酶對預(yù)處理后的秸稈進(jìn)行酶解,進(jìn)一步確定了上述最佳預(yù)處理?xiàng)l件。利用最優(yōu)預(yù)處理秸稈進(jìn)行酶解,通過一系列實(shí)驗(yàn)確定了最佳酶解條件:三角瓶中裝入100mL漿濃度為3%的預(yù)處理秸稈,纖維素酶用量為100U/g,木聚糖酶用量為600 U/g,酶解pH值為4.8,48℃恒

3、溫培養(yǎng)箱中搖瓶酶解72h。此時(shí)酶解液中還原糖含量積累達(dá)到最大,為25.6mg/mL。
　　以實(shí)驗(yàn)室保藏的綠色木霉為出發(fā)菌株,通過兩次紫外與兩次DES的交替誘變對綠色木霉的出發(fā)菌株進(jìn)行了誘變篩選。在以醋酸纖維素鈉為唯一碳源的剛果紅培養(yǎng)基上篩選出一株透明圈較大的菌株 Hc=2.1,經(jīng)多次復(fù)篩后,得到了一株生長較好酶活較高的突變株,編號(hào)T.viride8140UEUE4-80,其纖維素酶活達(dá)到了22.79U/mL、FDA酶活達(dá)到了2.5

4、6U/mL、木聚糖酶活達(dá)到了38.09U/mL,分別比原始菌株提高了2倍、1.5倍和1.3倍。對突變株的傳代穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,得到的突變株產(chǎn)酶穩(wěn)定性良好,酶活下降極少,說明獲得的突變株T.viride8140UEUE4-80可以用來進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。
　　對綠色木霉突變株Trichoderma viride8140UEUE4-80的液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)通過對菌株液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源、氮源、pH值、金屬離子及表面活

5、性劑的研究,確定了最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基中各成分及其含量:1000mL營養(yǎng)鹽成分:(NH4)SO42.0g/L、KH2PO42.0g/L、Urea0.3g/L、Peptone0.75g/L、CaCl20.3g/L、MgSO40.3g/L、FeSO4﹒7H2O5.0mg/L、MnSO4﹒H2O1.6mg/L、ZnSO4﹒7H2O1.4mg/L、CoCl22.0mg/L,微晶纖維素10g/L,麩皮10g/L,吐溫-802mL/L,pH6。實(shí)驗(yàn)通過對

6、菌株液態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)條件的研究,包括培養(yǎng)溫度、裝液量與搖床轉(zhuǎn)速、接種方式及接種量。確定了最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度28℃、裝液量為50mL/300mL、搖床轉(zhuǎn)速為180r/min、接種方式為種子液接種、接種量為5%。在此培養(yǎng)條件下,以最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后, CMCase達(dá)到24.91U/mL、FPA酶活達(dá)到2.81U/mL、木聚糖酶活達(dá)到105.5U/mL,三種酶活均有明顯提高。
　　在固體培養(yǎng)下探討了綠色木霉突變株的產(chǎn)酶情況,對產(chǎn)

7、酶最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn):
　　1)對產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源、氮源及無機(jī)鹽離子進(jìn)行了研究,確定了最佳固態(tài)培養(yǎng)基成分為:麩皮:秸稈:豆粕=6:3:1、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸銨0.45%、尿素0.15%、無水氯化鈣0.15%、七水硫酸鎂0.2%。
　　2)固定最佳培養(yǎng)基后,分別對產(chǎn)酶過程中的含水量、裝料量、溫度及接種量進(jìn)行研究,確定了綠色木霉T.viride8140UEUE4-80在三角瓶中最佳固態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為:固液比為

8、1:2、裝料量為20g/500mL(此時(shí)培養(yǎng)基厚度為1cm)、培養(yǎng)溫度為32℃及接種量為10%。在此培養(yǎng)條件下CMCase達(dá)到47.04U/g、FPA酶活達(dá)到10.07U/g、木聚糖酶活達(dá)到1015U/g。
　　3)在三角瓶固態(tài)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,按在三角瓶中固態(tài)培養(yǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件,進(jìn)行了曲盒中的擴(kuò)大培養(yǎng)的研究,綠色木霉在曲盒中固態(tài)培養(yǎng)條件下生長較好,最高CMCase達(dá)到43.3U/g、FPA酶活達(dá)到8.2U/g、木聚糖酶活994U