以堿處理玉米棒芯為原料直接生產(chǎn)丁醇的厭氧梭菌混菌發(fā)酵過(guò)程及代謝工程研究.pdf

1、丁醇是一種大宗的化工原料和新一代的可再生替代能源。近年來(lái)，在化石資源枯竭、環(huán)境污染加劇等多重壓力下，傳統(tǒng)的丁醇發(fā)酵，特別是以豐富廉價(jià)可再生的木質(zhì)纖維素為原料的丙酮丁醇發(fā)酵被重新重視起來(lái)。木質(zhì)纖維素丁醇的生產(chǎn)過(guò)程涉及纖維素酶類(lèi)的生產(chǎn)，木質(zhì)纖維素的酶法降解，己糖、戊糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用以及丁醇發(fā)酵等多個(gè)步驟，工藝復(fù)雜，使得木質(zhì)纖維素產(chǎn)丁醇成本居高不下，缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。利用某些厭氧菌分泌的多酶復(fù)合體——纖維小體，統(tǒng)合生物加工工藝(consolida

2、ted bioprocessing，CBP)能將產(chǎn)酶、水解和溶劑發(fā)酵集成在一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行，可以有效簡(jiǎn)化工藝，減少操作費(fèi)和設(shè)備費(fèi)，降低成本，提高效率。
　　要利用CBP法高效生產(chǎn)丁醇，參與該過(guò)程的微生物，既要能夠高產(chǎn)多種木質(zhì)纖維素水解酶類(lèi)，又要能夠高效利用水解得到的己糖、戊糖生產(chǎn)丁醇。這可以通過(guò)兩類(lèi)方法實(shí)現(xiàn):一是將厭氧的木質(zhì)纖維素降解菌和能同時(shí)利用己糖和戊糖的丁醇生產(chǎn)菌混菌培養(yǎng);二是對(duì)纖維素降解菌進(jìn)行遺傳改造，賦予其丁醇生產(chǎn)能力，

3、或者對(duì)丁醇生產(chǎn)菌進(jìn)行遺傳改造，賦予其木質(zhì)纖維素降解能力。本論文在這兩方面都進(jìn)行了探索。
　　本文首先考察了3種研究得較多的纖維小體生產(chǎn)厭氧梭菌——解纖維梭菌、熱纖梭菌和嗜纖維梭菌對(duì)堿處理后的玉米棒芯(alkali extracted corn cobs，AECC)的發(fā)酵特性。分析和比較了三種菌在AECC降解、可發(fā)酵糖累積、發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)等方面的優(yōu)劣勢(shì)后，發(fā)現(xiàn)熱纖梭菌在AECC降解和可發(fā)酵糖的累積上有明顯優(yōu)勢(shì)，而嗜纖維梭菌在AECC

4、降解和有機(jī)酸（特別是丁酸）生產(chǎn)上有明顯優(yōu)勢(shì)，均可能適宜與丁醇生產(chǎn)菌混菌發(fā)酵。解纖維梭菌由于生長(zhǎng)和代謝緩慢，暫不考慮作為纖維素降解菌用于混菌培養(yǎng)。
　　為克服前人研究時(shí)遇到的混菌發(fā)酵過(guò)程中溶劑發(fā)酵總停留在產(chǎn)酸階段的問(wèn)題，我們提出了一種新的熱纖梭菌和拜氏梭菌偶聯(lián)發(fā)酵策略，即先累積充足的可發(fā)酵糖后再開(kāi)始ABE發(fā)酵。根據(jù)可發(fā)酵糖的累積和ABE發(fā)酵對(duì)CBP過(guò)程的影響，分別考察了熱纖梭菌和拜氏梭菌的培養(yǎng)條件。并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化了雙茵混合培

5、養(yǎng)的方法。在組合優(yōu)化條件下，熱纖梭菌和拜氏梭菌偶聯(lián)發(fā)酵體系在不到200 h內(nèi)降解了88.9 g/L的AECC，生產(chǎn)了19.9 g/L的總?cè)軇?.96 g/L的丙酮，10.9 g/L的丁醇以及5.04 g/L的乙醇。相比于優(yōu)化前，AECC降解提高了81.0％，溶劑產(chǎn)量提高了70.3％。
　　在上述混菌培養(yǎng)體系中，由于熱纖梭菌與拜氏梭菌的培養(yǎng)溫度不匹配，導(dǎo)致偶聯(lián)發(fā)酵過(guò)程分兩階段進(jìn)行，對(duì)溶劑的生產(chǎn)強(qiáng)度造成了一定的影響。雖然嗜纖維梭

6、菌的生長(zhǎng)速率略慢于熱纖梭菌，但其最適生長(zhǎng)溫度與拜氏梭菌接近，有利于實(shí)現(xiàn)同步糖化發(fā)酵。此外，嗜纖維梭菌在降解纖維素的同時(shí)還能生產(chǎn)一定量的丁酸，可為拜氏梭菌提供更多的丁醇生產(chǎn)前體。因此，論文還構(gòu)建了嗜纖維梭菌與拜氏梭菌恒溫混菌培養(yǎng)體系。通過(guò)對(duì)混菌培養(yǎng)過(guò)程中拜氏梭菌接種時(shí)機(jī)、兩菌接種比例、pH控制策略等條件的考察和優(yōu)化，該混菌體系在88 h內(nèi)降解了68.6g/LAECC，生產(chǎn)了11.8g/L的溶劑，其中乙醇0.87 g/L，丁醇8.30 g/

7、L，丙酮2.64g/L。與熱纖梭菌與拜氏梭菌的偶聯(lián)發(fā)酵體系相比，嗜纖維梭菌與拜氏梭菌恒溫混菌發(fā)酵體系的溶劑產(chǎn)量雖然略低一些，但發(fā)酵時(shí)間縮短了近120 h，丁醇生產(chǎn)強(qiáng)度提高了90.6％。此外，還利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測(cè)了兩菌在混菌發(fā)酵過(guò)程中數(shù)量和比例的變化情況，初步分析了兩菌種群之間的競(jìng)爭(zhēng)與合作關(guān)系，但是這種關(guān)系的分子機(jī)制仍有待研究。
　　由于混菌發(fā)酵過(guò)程需要兼顧不同微生物的生長(zhǎng)和代謝特點(diǎn)，調(diào)控較單菌發(fā)酵略為復(fù)雜。為實(shí)現(xiàn)嗜纖維梭菌

8、單獨(dú)利用AECC生產(chǎn)丁醇，嘗試建立了嗜纖維梭菌的遺傳操作系統(tǒng)。借鑒丙酮丁醇的電轉(zhuǎn)方法，在篩選出合適的抗性標(biāo)記和復(fù)制子的基礎(chǔ)上，首次建立了嗜纖維梭菌的電轉(zhuǎn)化方法，成功將質(zhì)粒pXY1通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入嗜纖維梭菌中。對(duì)影響質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化的因素做了考察和優(yōu)化，優(yōu)化后質(zhì)粒pXY1的電轉(zhuǎn)化效率達(dá)到76.8/μg DNA，相比于優(yōu)化前提高了15.7倍。
　　考察了嗜纖維梭菌對(duì)丁醇的耐受性，發(fā)現(xiàn)嗜纖維梭菌在10 g/L的丁醇濃度下，仍能較好地生長(zhǎng)。將來(lái)自

9、丙酮丁醇梭菌的醇醛脫氫酶基因adhE2(CA-P0035)在嗜纖維梭菌中過(guò)表達(dá)，首次實(shí)現(xiàn)了梭菌單獨(dú)直接利用木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)正丁醇，但丁醇產(chǎn)量只有0.374 g/L，推測(cè)可能與競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑過(guò)多及還原力供應(yīng)不足有關(guān)。
　　利用新開(kāi)發(fā)的嗜纖維梭菌的遺傳操作系統(tǒng)，構(gòu)建了嗜纖維梭菌丁酸激酶過(guò)表達(dá)突變株743B(pXY1-Pptb-Clocel buk)和拜氏梭菌的酸回用途徑增強(qiáng)突變株8052(pXY1-Pptb-Cbei ctfA/B)，

10、初步的間歇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，二者混菌培養(yǎng)在108 h內(nèi)，降解了54.5 g/L AECC，生產(chǎn)了9.32 g/L溶劑，其中丙酮1.73 g/L，丁醇6.47g/L，乙醇1.12 g/L。與出發(fā)野生型菌株的混菌過(guò)程相比，AECC降解僅增加了16.5％，但是丁醇產(chǎn)量提高了57.4％，說(shuō)明在嗜纖維梭菌和拜氏梭菌中分別增強(qiáng)丁酸生產(chǎn)途徑及酸回用途徑的過(guò)表達(dá)確實(shí)提高了AECC的丁醇和溶劑轉(zhuǎn)化率。通過(guò)分批補(bǔ)料策略，在108 h內(nèi)，混菌體系分解了75.8