以木質纖維素為原料發(fā)酵生產丙酮丁醇的過程以及科學機理研究.pdf

1、隨著石油資源短缺、石油價格的不斷上揚、以及人們對能源、環(huán)境問題重視程度的提高，生物丁醇作為能源產品正在受到越來越廣泛重視。本文以玉米芯為原料進行了丁醇發(fā)酵研究。同時分別對玉米芯原料的濕磨預處理工藝、酶水解底物的粒徑分布與木質纖維素酶水解速率的相關性、利用梭菌生產丙酮丁醇時葡萄糖與/或木糖的消耗速率以及不同碳源對于梭菌相關基因的轉錄水平的影響、玉米芯水解液發(fā)酵產丁醇的工藝等進行了研究。這些研究成果為發(fā)展木質纖維素原料生產丁醇技術提供了理論

2、基礎。
　　 本論文的主要研究結果如下：
　　 1.酶水解底物粒徑分布和木質纖維素酶水解速率相關性的研究
　　 利用濕磨法對玉米芯原料進行預處理，并對濕磨預處理次數(shù)、磨盤間隙等對預處理效果的影響進行了比較。通過酶解反應對預處理效果進行驗證，葡萄糖與木糖的得率分別為71.3％和39.1％，還原糖得率較之未經濕磨預處理組提高了2.24倍。分析發(fā)現(xiàn)，物料濕磨預處理前后并不會生成糠醛和5－羥甲基糠醛等對后續(xù)發(fā)酵有抑制作用

3、的抑制物，水解液可以直接用于后續(xù)發(fā)酵過程。另外，通過SEM分析預處理前后樣品，發(fā)現(xiàn)濕磨預處理不僅能夠使原料粒徑大幅度減小，同時能破壞原料的致密結構，使原料呈現(xiàn)絮狀，纖維結構大大暴露，增加了纖維素酶與纖維素鏈的接觸面積。而X射線衍射試驗表明，濕磨預處理方法對于原料纖維素結晶度影響不大。通過粒徑分布研究，發(fā)現(xiàn)粒徑分布的Frequency90％值能夠快速且準確的判定濕磨預處理過程的終點，為濕磨預處理方法的工業(yè)化應用奠定了基礎。
　　

4、2.濕磨預處理玉米芯原料發(fā)酵生產ABE研究
　　 本研究直接利用濕磨預處理玉米芯原料水解液發(fā)酵生產ABE，其發(fā)酵過程與純糖作為碳源的對照組相比較，發(fā)現(xiàn)前者的發(fā)酵速率沒有被抑制，說明在預處理過程中沒有產生抑制微生物生產丙酮丁醇的毒性物質。預處理后的原料無需進行脫毒處理便可直接用于ABE發(fā)酵，大大簡化了操作程序并降低了生產成本。
　　 當以30 g/L葡萄糖為唯一碳源時，經過60 h發(fā)酵，葡萄糖基本耗盡，ABE生產速率與得率

5、分別為0.20 g/L·h和0.36 g/g還原糖。當以35 g/L葡萄糖與25 g/L木糖組成的混合糖作為碳源時，經過72 h發(fā)酵，結束時仍有44％的木糖剩余，ABE生產速率與得率分別為0.22 g/L·h和0.35 g/g糖。玉米芯水解液發(fā)酵過程(SHF)ABE生產速率與得率分別為0.17 g/L·h和0.34 g/g還原糖，與葡萄糖組及混合糖組相似。結果說明濕磨預處理玉米芯原料可以用于發(fā)酵生產ABE。相對于SHF工藝中0.12 g

6、/L·h的ABE生產速率，SSF中的ABE生產速率較高，為0.15 g/L·h。分析原因，可能是因為SSF中同步糖化與發(fā)酵過程中水解產生的單糖被轉化成丙酮丁醇，消除了底物抑制，從而提高了底物水解效率所致。通過對SHF與SSF兩種工藝中物料與能量進行衡算，SSF工藝中的能量得率為142％，高于SHF工藝的112％。上述結果表明，濕磨法是一種溫和的預處理方法，預處理過程中不會生成對后續(xù)發(fā)酵有抑制作用的副產物，減化了工藝的后續(xù)脫毒過程并降低了

7、成本，經過其處理的玉米芯可以被用作生產ABE的原料。
　　 3.同步利用混合糖生產丙酮丁醇菌糖代謝特性研究
　　 通過富集、分離獲得一株能夠同步代謝葡萄糖與木糖產丁醇的菌株，經過形態(tài)及16S rRNA分析，初步鑒定為Clostridium beijerinckii，命名為SE-2。菌株SE-2分別以葡萄糖或木糖為碳源時的糖初始利用速率分別為0.8 g/L·h和1.0 g/L·h，兩種糖的利用速率基本相同。改變培養(yǎng)基中葡萄

8、糖與木糖比例為1:2，2:1與1:1，發(fā)酵過程中兩種糖仍能同步利用，而且糖利用速率基本一致，分別為0.57 g/L·h、0.55 g/L·h和0.56 g/L·h。此外，利用補糖方式對SE-2的葡糖糖與木糖利用特點研究發(fā)現(xiàn)，當發(fā)酵過程由單糖轉化為雙糖時，原有單糖的利用速率下降，但是雙糖的利用速率之和基本維持與補糖前一致，說明只要有葡萄糖或者木糖存在，SE-2便能立刻啟動對該糖的代謝過程。發(fā)酵過程動力學分析進一步說明，菌株SE-2不僅可以

9、同步利用葡萄糖與木糖，而且木糖初始代謝速率要略高于葡萄糖。
　　 4.C.beijerinckii SE-2發(fā)酵玉米芯水解液產丁醇條件的優(yōu)化
　　 以玉米芯水解液為原料，進行了C.beijerinckii SE-2生產丁醇發(fā)酵工藝優(yōu)化實驗研究。首先通過單因素法對產丁醇條件進行了初步優(yōu)化，然后通過響應面設計對培養(yǎng)基進行進一步優(yōu)化，最后獲得優(yōu)化工藝條件。在此條件下，丁醇濃度達到11.71 g/L，比優(yōu)化前提高42％。在優(yōu)化條

10、件下進行玉米芯水解液發(fā)酵生產丁醇的驗證實驗，分批次發(fā)酵(5次)，丁醇產量平均值為11.65±0.47 g/L，實驗值與理論預測值非常接近，可見該模型可以較好地預測C.beijerinckii SE-2利用玉米芯水解液產丁醇的實際發(fā)酵情況。菌株優(yōu)化后將酵母粉替換為相對便宜的玉米漿，這為工業(yè)化放大奠定了基礎。
　　 5.利用梭菌生產丙酮丁醇時葡萄糖與/或木糖的消耗速率以及不同碳源對于梭菌相關基因的轉錄水平的影響
　　 本研究

11、中利用R-T-qPCR對C.beijerinckii SE-2中10個與木糖代謝相關的基因(Cbei_4126、Cbei__0549、Cbei_4455、Cbei_2657、Cbei_0109、Cbei_2389、Cbei_4457、Cbei_4448、Cbei_2385和Cbei_2384)在不同碳源條件下的轉錄差異進行了分析。發(fā)現(xiàn)這些基因在不同碳源(葡萄糖、木糖或葡萄糖與木糖)發(fā)酵過程中在轉錄水平上是有差異的且都受葡萄糖阻遏。其中基

12、因Cbei_2384、Cbei_2385和Cbei_2389可能存在于同一操縱子上，參與了木糖至5-磷酸-木酮糖轉化過程。與文獻報道中C.beijerinckii相關基因轉錄情況不同，基因Cbei_2384、Cbei_2385和Cbei_2389在混合糖發(fā)酵過程中轉錄水平明顯下降，說明“葡萄糖阻遏效應”在菌株C.beijrinckii SE-2中依然存在。通過分析，推測菌株C.beijerinckii SE-2葡萄糖與木糖同步代謝的關鍵