基于微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)構(gòu)建水產(chǎn)品中微生物預(yù)測(cè)模型.pdf

1、本課題主要是運(yùn)用real-time PCR絕對(duì)定量和16SrDNA PCR-DGGE指紋圖譜數(shù)字化的方法建立南美白對(duì)蝦中微生物(單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、腸炎沙門氏菌、假單胞菌和巨型球菌)的預(yù)測(cè)模型。
　　首先,在4℃和10℃溫度條件下,建立單增李斯特氏菌和副溶血性弧菌在南美白對(duì)蝦上的預(yù)測(cè)模型。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用了傳統(tǒng)的涂布計(jì)數(shù)法、real-time PCR定量檢測(cè)方法和DGGE方法,并將傳統(tǒng)方法和這兩種分子方法所建立的預(yù)測(cè)進(jìn)行比

2、較,分析分子生態(tài)學(xué)建立微生物模型的可行性及可靠性。
　　用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)單增李斯特氏菌相關(guān)系數(shù)(R2)、最大比生長(zhǎng)速率(μmax)、延滯期(?)、最大細(xì)胞濃度(A)進(jìn)行顯著性分析,較傳統(tǒng)涂布方法與real-time PCR方法所得參數(shù)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。用real-time PCR方法建立副溶血性弧菌預(yù)測(cè)模型,通過(guò)分析主要是因?yàn)楦比苎曰【诘蜏厥浅蔬f減趨勢(shì),而在低溫條件下副溶血性弧菌會(huì)進(jìn)入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)(VBNC狀態(tài)

3、),該狀態(tài)的細(xì)菌無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)涂布計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù),然而用real-time PCR方法通過(guò)DNA的提取就可以對(duì)DNA進(jìn)行定量,從而得到細(xì)菌數(shù)量。所以real-time PCR定量方法可以用于建立微生物預(yù)測(cè)模型。
　　DGGE方法所得數(shù)據(jù)對(duì)單增李斯特氏菌的擬合結(jié)果與傳統(tǒng)方法相似度和很高,而描述4℃和10℃時(shí)副溶血性弧菌的數(shù)量變化趨勢(shì)存在一定偏差。4℃時(shí),傳統(tǒng)方法和DGGE方法描述的副溶血性生長(zhǎng)趨勢(shì)是相同的,而10℃時(shí),這兩種方法所得的模

4、型趨勢(shì)不同,這一現(xiàn)象需進(jìn)一步研究。由于本文是首次提出并運(yùn)用DGGE方法建立微生物預(yù)測(cè),該方法處于起步階段,存在一定的缺陷,但是由于DGGE一次可以觀察多種菌,可以明顯看出微生物生長(zhǎng)的趨勢(shì),在預(yù)測(cè)微生物領(lǐng)域還是很有發(fā)展的潛力。
　　其次,通過(guò)上一章的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得出用分子生態(tài)學(xué)建立微生物預(yù)測(cè)模型的可行性。所以,在4℃和10℃溫度條件下,用分子生態(tài)學(xué)建立五株菌(單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、腸炎沙門氏菌、假單胞菌和巨型球菌)在南美白對(duì)蝦

5、上的生長(zhǎng)的預(yù)測(cè)模型。
　　real-time PCR定量數(shù)據(jù)模型擬合結(jié)果:4℃和10℃這兩個(gè)溫度下,不同模型對(duì)單增李斯特氏菌的擬合相關(guān)系數(shù)R2均在0.9以上。4℃和10℃時(shí),只有Baranyi模型適合用于腸炎沙門氏菌和巨型球菌生長(zhǎng)的擬合。相同的數(shù)據(jù)不同的模型擬合效果不同,所以需要對(duì)不同模型進(jìn)行選擇
　　同樣,對(duì)數(shù)字化的DGGE圖譜進(jìn)行模型的擬合,同樣得出4℃和10℃這兩個(gè)溫度下該方法對(duì)單增李斯特氏菌的擬合相關(guān)系數(shù)R2均在0.

6、9以上,對(duì)于假單胞菌的擬合相關(guān)系數(shù)有0.8以上,而對(duì)于其他3株菌的擬合相關(guān)系數(shù)R2低于0.7。副溶血弧菌在4℃條件是致死的一種情況,μmax是負(fù)值,而且只有Baranyi模型對(duì)單增李斯特氏菌和腸炎沙門氏菌擬合所得的延滯期是非負(fù)數(shù),所以Baranyi模型適合用于以上兩株菌的擬合。從模型擬合結(jié)果顯示,DGGE方法能很好的呈現(xiàn)微生物的生長(zhǎng)趨勢(shì)。
　　本文首次運(yùn)用DGGE方法對(duì)圖譜數(shù)字化并建立微生物預(yù)測(cè)模型;首次運(yùn)用real-time P

7、CR定量方法和DGGE方法所得數(shù)據(jù)同時(shí)建立了多株菌的預(yù)測(cè)模型。由于分子生物學(xué)快速、靈敏、特異性好等優(yōu)點(diǎn),real-time PCR方法已被用于微生物定量檢測(cè)。對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)室不能培養(yǎng)的微生物卻能用分子生物學(xué)方法定量,而且傳統(tǒng)的微生物計(jì)數(shù)方法通過(guò)一種選擇性培養(yǎng)基只能檢測(cè)一種微生物,而且在背景微生物復(fù)雜的情況下選擇性培養(yǎng)基的特異性就會(huì)收到干擾,所以分子生物學(xué)方法不但同時(shí)可以檢測(cè)多種微生物而且特異性好。運(yùn)用分子生物學(xué)定量方法來(lái)建立微生物預(yù)測(cè)模型

8、,在國(guó)內(nèi)外都是一個(gè)很新的概念?？紤]到樣品DNA提取、PCR操作、模型選擇等問(wèn)題運(yùn)用分子生態(tài)學(xué)建模還需要很多人進(jìn)一步的優(yōu)化條件,選擇更合適的模型。而DGGE方法雖然不能很準(zhǔn)確的反應(yīng)微生物的數(shù)量,但是從條帶的峰值可以間接的反應(yīng)微生物的量。但是,運(yùn)用于建立微生物預(yù)測(cè)模型還屬首創(chuàng),從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,用DGGE圖譜數(shù)字化方法建立微生物預(yù)測(cè)模型可以得出微生物的生長(zhǎng)趨勢(shì)。但是,運(yùn)用分子生態(tài)學(xué)方法建模還處于起步階段,但是由于該方法的一些優(yōu)越性,運(yùn)用